ここで説明するプロトコルにより、細菌の持続性に大きく影響する可能性のある条件を、高スループットで識別することができます。この方法は、薬物パネル、遺伝子ライブラリーなどの様々な領域のスクリーンに容易に適応可能である。この方法には同時に行われるさまざまなサブステップが含まれているため、視覚的なデモンストレーションは、研究者が正確な結果を得るためにタイミングを管理するのに役立つ。
マイクロアレイ細胞培養を準備するから始めます。指数相細胞の250マイクロリットルを50ミリリットル遠心管で25ミリリットルの新鮮な改変LB培地に移す。その後、細胞懸濁液を穏やかに混ぜて均質にします。
希釈した細胞懸濁液を無菌50ミリリットルの貯蔵所に移す。マルチチャネルピペットを使用して、細胞懸濁液の150マイクロリットルを様々な化学物質を含むマイクロアレイプレートの各ウェルに移す。マイクロアレイは、テキスト原稿に記載された方法に従って手動で生成することもできる。
マイクロアレイプレートにガス透過性の天井膜を覆い、摂氏37度、250RPMの軌道シェーカーで24時間インキュベートします。パーシスターアッセイプレートを作るには、50ミリリットル遠心分離管にOfloxacatの1ミリリットル当たり5マイクログラムを含む25ミリリットルの修飾LB培地を調製し、この培地を無菌貯留槽に移します。修正されたLB培地の190マイクロリットルを一般的なフラットボトム96ウェルプレートの各ウェルに移します。
24時間インキュベーション後、シェーカーからマイクロアレイを取り出し、10マイクロリットルの細胞培養液をマイクロアレイから、オフロキサシンとの改質LB培地を含むパーシスターアッセイプレートのウェルに移します。パーシスターエッセイプレートから10マイクロリットルの細胞懸濁液を取り出し、ラウンドボトム96ウェルプレートとマルチチャンネルピペットを使用してPBS溶液の290マイクロリットルで3回連続希釈します。その後、抗生物質を含まない新鮮な寒天プレートに、連続希釈された細胞懸濁液の10マイクロリットルを見つけます。
パーシスターアッセイプレートをガス透過性の天井膜で覆い、摂氏37度、250 RPMの軌道シェーカーで6時間インキュベートします。6時間のインキュベーションの後、寒天プレートに連続希釈とスポッティングを繰り返します。寒天プレートを摂氏37度で16時間インキュベートします。
次にコロニー形成ユニットまたはCFUsを数えます。抗生物質治療の前と6時間後にCFUレベルを使用して、各井戸のパーシスター分数を計算します。OfX治療前のCFUカウントはまた、大腸菌の生存率に対するオスモリトの影響を評価するのに役立ちます。
マイクロアレイスクリーニングから同定されたオスモライトを含む新しい改変LB培地の250マイクロリットルの指数相細胞を25ミリリットルに移す。250 RPM、摂氏37度でフラスコを24時間インキュベートします。24時間後、シェーカーからフラスコを取り出し、250ミリリットルのバッフルフラスコ中の新鮮な改変LB培地の25ミリリットルに細胞培養物250マイクロリットルを移す。
25マイクロリットルのOfloxacinストック溶液を細胞懸濁液に加え、フラスコを穏やかに振ってアッセイ培養を均質にします。フラスコを摂氏37度と250RPMのシェーカーでインキュベートします。治療中の1時間ごとに、Ofloxacinを添加する前の時点を含め、フラスコから1ミリリットルのアッセイ培養液を1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移し、それを17,000回Gで3分間遠心分離する。
950マイクロリットルの上清を取り除き、950マイクロリットルのPBSで細胞を3回洗います。最終洗浄後、細胞ペレットを100マイクロリットルのPBS溶液で再懸濁する。細胞懸濁液を10マイクロリットルにして、96ウェルラウンドボトムプレート内の90マイクロリットルのPBSで6回連続して希釈します。
抗生物質フリー寒天プレートに希釈された細胞懸濁液の10マイクロリットルを見つける。検出の限界を高めるには、新鮮な寒天プレートに残りの90マイクロリットルの細胞懸濁液をプレートします。プレートを摂氏37度で16時間インキュベートし、CFUsを数えます。
OFX処理前後の細胞培養のCFUレベルを決定するために使用される寒天プレートの代表的な画像をここに示す。最初の列は制御グループです。第2列は、100ミリモル硝酸ナトリウムで培養した細胞を有し、第3列には、60ミリモルの硝酸ナトリウムで培養した細胞が含まれている。
簡単にするために、ここで焦点を当てているのは2つのオスモリ素だけです。96のウェルプレートでテストされた細胞培養物のプレートとパーシスター分画からのCFUデータのグラフィカルな表現をここに示す。分数を計算するために、パーシスター数は抗生物質治療前に得られた細胞数に正規化した。
バイファシスキル曲線を生成するために、細胞を示されたオスモリ酸剤とバッフルフラスコを用いて25ミリリットルの修飾LB培地で24時間培養し、パーシスター列挙のためにパーシスターアッセイフラスコに移した。このプロトコルを試みるとき、寒天プレート上の細胞を見つけることは労働集約的であり、焦点を必要とすることに注意してください。ステップ中のエラーは、テストされている条件間でクロスコンタミネーションにつながる可能性があります。
したがって、実験の前に複数のサンプルを同時に見つける練習が重要です。このプロトコルに従って、薬剤パネルおよび変異細胞ライブラリーをスクリーニングして、持続性への影響を調べることができる。このスクリーニングにより、細菌の持続性に大きな影響を与える多数のオスモリトおよびPS条件を同定しました。
