הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר לזהות תנאים שיכולים להשפיע באופן משמעותי על התמדה חיידקית באופן בעל תפוקה גבוהה. שיטה זו ניתנת להתאמה בקלות למסך בתחומים שונים, כגון לוחות תרופות, ספריות גנים ועוד. מכיוון שהשיטה כוללת צעדי משנה שונים, שאמורים להתבצע בו זמנית, הדגמה חזותית יכולה לסייע לחוקרים לנהל את העיתוי שלהם כדי להשיג תוצאות מדויקות.
התחל על ידי הכנת תרביות תא microarray. העבר 250 מיקרוליטרים של תאי פאזה אקספוננציאליים ל-25 מיליליטר של מדיום LB שונה טרי בצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר. ואז בעדינות לערבב את ההשעיה התא כדי להפוך אותו הומוגני.
להעביר את השעיית התא מדולל לתוך מאגר סטרילי 50 מיליליטר. באמצעות פיפטה רב ערוצית, להעביר 150 microliters של השעיית התא לכל באר של צלחת microarray המכיל כימיקלים שונים. Microarrays יכול גם להיווצר באופן ידני בעקבות השיטה המתוארת בכתב היד טקסט.
מכסים את לוחית המיקרו-ראי בקרום תקרה חדיר לגז ומדגרים אותו בשייקר מסלולי ב-37 מעלות צלזיוס וב-250 סל"ד למשך 24 שעות. כדי להפוך את לוחות ההסמכה מתמיד, להכין 25 מיליליטר של מדיום LB שונה המכיל חמישה מיקרוגרם למיליליטר של Ofloxacin בצינור צנטריפוגה 50 מיליליטר ולהעביר את המדיום הזה למאגר סטרילי. העבר 190 מיקרוליטרים של מדיום LB שונה לתוך כל באר של צלחת שטוחה גנרית 96 היטב.
לאחר הדגירה 24 שעות ביממה, להסיר את microarray מן שייקר ולהעביר 10 microliters של תרביות התא מן microarray אל בארות של צלחת בדיקה מתמיד המכיל מדיום LB שונה עם Ofloxacin. קח 10 מיקרוליטרים של מתלי תאים מלוח החיבור מתמיד באופן סדרתי לדלל אותו שלוש פעמים ב 290 microliters של פתרון PBS באמצעות צלחת עגולה 96 גם פיפטה רב ערוצית. ואז לזהות 10 microliters של כל השעיות תאים בדילול סדרתי על צלחות אגר טרי ללא אנטיביוטיקה.
מכסים את צלחת ההסמכה המתמדת בקרום תקרה חדיר לגז ומדגרים אותה בשייקר מסלולי ב-37 מעלות צלזיוס ו-250 סל"ד למשך שש שעות. לאחר הדגירה בת שש השעות, חזרו על הדילול הסדרתי והבחינו בצלחות אגר. דגירה צלחות אגר במשך 16 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן לספור את המושבה להרכיב יחידות או CFUs. השתמש ברמות CFU לפני ושש שעות לאחר הטיפול האנטיביוטי כדי לחשב את השבר המתמשך בכל באר. CFU נחשב לפני הטיפול OFX גם לעזור להעריך את ההשפעות של osmolites על הכדאיות e coli.
העבר 250 מיקרוליטרים של תאי פאזה אקספוננציאליים ל-25 מיליליטר של מדיום LB שונה טרי המכיל את האוסמוליט שזוהה מההקרנה של המיקרו-קרינה. דגירה את הבקבוק בשייקר מסלולי ב 250 סל"ד ו 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות. לאחר 24 שעות, להסיר את הבקבוק מן שייקר ולהעביר 250 microliters של תרבות התא ל 25 מיליליטר של מדיום LB שונה טרי בבקבוק 250 מיליליטר מבולבל.
הוסיפו 25 מיקרוליטרים של תמיסת מלאי Ofloxacin להשעיית התא ונערו את הבקבוק בעדינות כדי להפוך את תרבות התספורת להומוגנית. דגירה את הבקבוק בשייקר ב 37 מעלות צלזיוס ו 250 סל"ד. בכל שעה במהלך הטיפול, כולל נקודת זמן לפני הוספת Ofloxacin, להעביר מיליליטר אחד של תרבות התסעפות מן הבקבוק לצינור מיקרו צנטריפוגה 1.5 מיליליטר וצנטריפוגה אותו ב 17, 000 פעמים G במשך שלוש דקות.
הסר 950 מיקרוליטרים של supernatant ולשטוף את התאים שלוש פעמים עם 950 microliters של PBS. לאחר הכביסה הסופית, להשעות מחדש את גלולת התא ב 100 microliters של פתרון PBS. קח 10 מיקרוליטרים של המתלים התא באופן סדרתי לדלל אותו שש פעמים עם 90 microliters של PBS בתוך צלחת 96 גם עגול התחתון.
ספוט 10 microliters של השעיות תא מדולל על צלחת אגר ללא אנטיביוטיקה. כדי להגדיל את מגבלת הגילוי, צלחת 90 microliters הנותרים של השעיית תא על צלחת אגר טרי. דגירה הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות, ואז לספור CFUs.
תמונה מייצגת של לוחות אגר המשמשים לקביעת רמות CFU של תרביות תאים לפני ואחרי טיפול OFX מוצג כאן. העמודה הראשונה היא קבוצת הביקורת. בעמודה השנייה יש תאים שתרביתו ב-100 מילימולאר נתרן חנקתי והעמודה השלישית מכילה תאים שתרביתו ב-60 מילימולאר נתרן חנקתי.
לפשטות, רק שני אוסמוליטים מתמקדים כאן. ייצוג גרפי של נתוני CFU מן הלוחות שברים מתמידים של תרביות התא נבדק 96 לוחות באר מוצגים כאן. כדי לחשב את השברים, ספירות מתמידים נורמלו לספירת התאים שהושגו לפני הטיפול האנטיביוטי.
כדי ליצור עקומות להרוג byphasic, התאים היו מתורבתים 25 מיליליטר של מדיום LB שונה עם osmolites המצוין ובקבוקים מבולבלים במשך 24 שעות, ולאחר מכן הועברו צלושי assay מתמיד לספירה מתמיד. בעת ניסיון פרוטוקול זה, יש לזכור כי איתור התאים על צלחת אגר הוא עבודה אינטנסיבית ודורש מיקוד. שגיאה במהלך הצעד יכולה להוביל לזיהום צולב בין התנאים הנבדקים.
לכן חשוב לתרגל איתור דגימות מרובות בו זמנית לפני הניסוי. בעקבות פרוטוקול זה, לוחות סמים וספריות תאים מוטנטים ניתן לסנן כדי ללמוד את ההשפעות על ההתמדה. עם הקרנה זו, זיהינו מספר osmolites ותנאי PS שיש להם השפעה משמעותית על התמדה חיידקית.
