ترتبط العديد من المواد المسببة للحساسية بالجزيئات الكارهة للماء. هذا البروتوكول يتيح إزالة واستبدال هذه ligands كاملة، مما يسمح لنا لدراسة تأثيرها على الهيكل والمناعة بطريقة منهجية. استخدام HPLC عكس المرحلة، إلى جانب التلين الحراري، له ميزتين.
يزيل ليغاندس الذاتية، ويساعد على تليين ليغاندس لفتح مواقع ملزمة خلاف ذلك لا يمكن الوصول إليها. إذا تمكنا من تحديد العوامل التي تساهم في مسببات الحساسية، فقد نتمكن من تصميم علاجات تتجنب هذه العوامل. العديد من البروتينات ربط ليغاندس الدهون، والتي يتم الاحتفاظ بها بقوة، ويمكن أن تؤثر على كل من الهيكل والوظيفة.
تسمح طريقتنا بالدراسة المنهجية لهذه التفاعلات. وقد تحول قلة قابلية الذوبان وإمكانية الوصول للعديد من شحنات الدهون دون عملية التحميل. تأكد من الاهتمام عند إعداد هذه ligands ، والنظر في الحاجة إلى تعديلات النظام محددة.
كما العمل مع ليغاندس مسعور وغير قابل للذوبان هو تعديل لبعض الحساسية والكيمياء الحيوية، يمكن أن يكون من المفيد أن نرى ما تبدو عليه العينات في مراحل مختلفة. بعد استنساخ التعبير والتنقية، قم بتطبيق 12 ملليلتر من Bla g 1 المشقوق على وحدة فلترة الطرد المركزي مع قطع الوزن الجزيئي أقل من 10 كيلودالتون لأجهزة الطرد المركزي المتعددة في دوار دلو أرجوحة حتى يتم تقليل الحجم الإجمالي إلى أقل من ملليلترين. قم بتحميل التركيز الناتج على نظام HPLC 250 في 10 ملليمتر مجهز بعمود كروماتوغرافي من المرحلة العكسية C18 متساوي التوازن بمعدل تدفق 97٪ عازل A و3٪ عازل B.Elute Bla g 1 بمعدل تدفق 1.5 إلى 4 ملليلتر في الدقيقة ، كما هو مبين في الجدول ، باستخدام امتصاص الفلورية عند 280 نانومتر لمراقبة عملية الإلتواء.
بدءا من حوالي 34 إلى 40 دقيقة وتركيز B العازلة فوق 74٪ جمع ما لا يزيد عن أربعة ملليلتر من كل جزء Bla g 1. Aliquot تجمع Bla g 1 كسر في أنابيب اختبار الزجاج. تغطية الأنابيب مع فيلم البارافين وثقب الفيلم مع اثنين من الثقوب.
ثم، تجميد العينات في ناقص 80 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة واستخدام الليسوفليس لتجفيف عينات البروتين إزالة الدهون الناتجة. لتحديد العائد المتوقع Bla g 1، إعادة تعليق اختبار مزيل الدهون lyophilized aliquot في خمسة ملليلتر من العازلة إعادة طيها. سخني الخليط في كوب 500 ملليلتر يحتوي على 250 ملليلتر من الماء إلى 95 درجة مئوية على طبق ساخن مع التحريك ودوامة متقطعة.
عقد الحل في 95 درجة لمدة 30 إلى 60 دقيقة قبل السماح للحمام المياه لتوازن ببطء لدرجة حرارة الغرفة. عندما يبرد الحل، مرر خليط الدهون Bla g 1 الم معلق من خلال فلتر حقنة 0.22 ميكرون لإزالة الجسيمات، واستخدم فلتر طرد مركزي جديد مع قطع 10 كيلودالتون لتبادل البروتين المصفى ثلاث مرات في PBS لإزالة أي أحماض دهنية حرة متبقية ومذيب عضوي. ثم، تقييم تركيز البروتين باستخدام معيار تحليل البروتين المقايسة لتحديد العائد المتوقع لaliquots Bla g 1 المتبقية.
لإعادة تشكيل Apo-Bla g 1، إعادة تعليق الاقتباسات Bla g 1 في خمسة ملليلترات من العازلة إعادة طيها لكل aliquot، و anneal العينات كما هو موضح. لتحميل Bla g 1 مع فوسفوليبيدات، أضف 10 ملليغرام من الشحنة المطلوبة إلى أنبوب اختبار زجاجي وتذوب في الكلوروفورم، وتتبخر الكلوروفورم لإنتاج فيلم الدهون. ثم، إضافة برنامج تلفزيوني إلى الأنبوب لإنتاج تركيز الفوسفوليبيد النهائي من 20 ملليمولار.
سخني الفوسفولبيد فوق درجة حرارة المرحلة الانتقالية للبضائع الدهنية لإعادة ترطيب فيلم الدهون، ودوامة حتى يتحول المحلول إلى غائم. ثم، إضافة البضائع الدهون فوسفو لإنتاج فائض الضرس 20X من الليجانات بالنسبة إلى Bla g 1 على أساس العائد المتوقع. قد تتشكل متسرعة.
دوامة لخلط قبل تميين البروتين كما هو موضح. لتأكيد إزالة البضائع أو تحميلها بواسطة الفوسفور-31 NMR، استخدم فلتر الطرد المركزي لتركيز العينة على أكثر من 100 ميكرومولار كما هو موضح. إعداد عينات الفوسفولبيد المرجعية من التركيزات المعروفة في المخزن المؤقت PBS كما هو مبين، وتمييع إشارة نهاية Bla g 1 إلى نسبة 1:1 مع حاجز المرارة إلى حجم إجمالي يبلغ حوالي 600 ميكرولتر.
استخدام مسبار النطاق العريض للحصول على أطياف NMR أحادية البعد، 31-الفوسفور من عينات Bla g 1 الممتلأة والمعايير المرجعية للفوسفولبيد، ومقارنة أطياف BLA g 1 31 الفوسفوري NMR لتلك التي تم الحصول عليها لعينات مرجعية فوسفولبيد لتأكيد إزالة ليغاندس ملزمة داخليا و / أو ربط ليغاندس المطلوب على أساس التحولات الكيميائية للقمم مرئية، ثم قارن كثافة الذروة من الطيف Bla g 1 إلى أن من المعايير المرجعية فوسفولبيد للسماح بتأكيد stoichiometry ملزمة كاملة. باستخدام الكروماتوغرافيا تقارب، يمكن عزل إعادة تركيب GST Bla g 1 بسهولة إلى مستوى عال من النقاء، وإنتاج عائد من 2-4 ملليغرام لكل لتر من ثقافة الخلية. الحضانة بين عشية وضحاها مع بروتياز TEV في أربع درجات مئوية كافية لإزالة علامة GST، مما أسفر عن المنتج النهائي في حوالي 24 كيلودالتون.
تطبيق Bla g 1 على عمود C18 في المرحلة العكسية ينتج عنه ملف تعريف elution مميز ، مع قمتين كبيرتين عند 50٪ من العازلة B ، وذروة كبيرة ثانية عند 75٪ عازلة B.Phosphorus-31 NMR spectra من Apo-Bla g 1 لا تظهر أي فوسفوليبيدات يمكن اكتشافها. ويمكن إنتاج منحنى قياسي من NMR باستخدام عينات مرجعية من تركيزات DSPC المعروفة. مقارنة كثافة إشارة 31 الفوسفور التي تم الحصول عليها من DSPC Bla g 1 ضد هذا المنحنى القياسي يمكن استخدامها لتسفر عن قياس الاستواء ملزمة من الدهون لكل بروتين.
أطياف dichroism دائرية لApo والدهون محملة Bla ز 1 تظهر مينيما من 220 و 210 نانومتر، مما يدل على هيكل ألفا-هيليكال في الغالب. كما تظهر مقايسات التشبع الحراري الدائرية المستندة إلى الديكروزم فقدانا تعاونيا للبنية الثانوية ألفا-هلية، مما يدل على مجال كروي مطوي. بالإضافة إلى ذلك ، يكشف تحليل درجات حرارة الذوبان الناتجة عن زيادة كبيرة على ربط nMix ligand ، بما يتفق مع Bla g 1 الذي تم الحصول عليه من مصدر مسببات الحساسية الطبيعية.
يعتمد نجاح هذا البروتوكول على القدرة على التغلب على كل من قابلية الذوبان المحدودة للليغند الكاره للماء ، والطبيعة التي يتعذر الوصول إليها لتجويف Bla g 1 الملزم. يضع هذا الإجراء الأساس للدراسات المناعية، مثل فحوصات انتشار الخلايا التائية، لتقييم تأثير الليغندات الدهنية على التوعية والآليات الجزيئية التي يحدث من خلالها ذلك. اقتران هذا الإجراء مع مزيد من المقايسات الفيزيائية الحيوية، أظهرنا أن ربط ليغاندس الكاره للماء يعزز الاستقرار Bla g 1، مع الآثار المحتملة المصب لتوليد epitope وحساسية.
