Viele Allergene binden hydrophobe Moleküle. Dieses Protokoll ermöglicht die vollständige Entfernung und den Ersatz dieser Liganden, so dass wir ihre Auswirkungen auf Struktur und Immunogenität systematisch untersuchen können. Der Einsatz von Umkehrphasen-HPLC, gekoppelt mit thermischem Glühen, hat zwei Vorteile.
Es entfernt endogene Liganden und hilft, Liganden zu solubilisieren, um ansonsten unzugängliche Bindungsstellen zu öffnen. Wenn wir die Faktoren bestimmen können, die zur Allergenität beitragen, können wir möglicherweise Therapien entwickeln, die diese Faktoren vermeiden. Viele Proteine binden Lipidliganden, die stark zurückgehalten werden und sowohl Struktur als auch Funktion beeinflussen können.
Unsere Methode ermöglicht die systematische Untersuchung dieser Wechselwirkungen. Die begrenzte Löslichkeit und Zugänglichkeit vieler Lipidladungen kann den Ladevorgang hemmen. Achten Sie darauf, bei der Vorbereitung dieser Liganden darauf zu achten und die Notwendigkeit systemspezifischer Anpassungen zu berücksichtigen.
Da die Arbeit mit hydrophoben und unlöslichen Liganden für einige Allergologen und Biochemiker eine Anpassung ist, kann es nützlich sein zu sehen, wie die Proben in verschiedenen Stadien aussehen. Nach der Klonexpression und -reinigung 12 Milliliter des gespaltenen Bla g 1 auf eine Zentrifugalfiltereinheit mit einer Molekulargewichtsabschaltung von weniger als 10 Kilodalton für mehrere Zentrifugationen in einem Schaufelrotor auftragen, bis das Gesamtvolumen auf weniger als zwei Milliliter reduziert wurde. Laden Sie das resultierende Konzentrat auf ein 250 x 10 Millimeter großes HPLC-System, das mit einer C18-Umkehrphasenchromatographiesäule ausgestattet ist, die mit 97% Puffer A und 3% Puffer B gleichgewichtet ist.Elute Bla g 1 bei einer Durchflussrate von 1,5 bis 4 Milliliter pro Minute, wie in der Tabelle angegeben, wobei die Fluoreszenzabsorption bei 280 Nanometern verwendet wird, um den Elutionsprozess zu überwachen.
Ab etwa 34 bis 40 Minuten und einer Puffer-B-Konzentration über 74% sammeln sich nicht mehr als vier Milliliter jeder Bla g 1-Fraktion. Aliquot die gepoolte Bla g 1 Fraktion in Glas Reagenzgläser. Decken Sie die Röhrchen mit Paraffinfolie ab und perforieren Sie die Folie mit zwei Löchern.
Anschließend die Proben eine Stunde lang bei minus 80 Grad Celsius einfrieren und die resultierenden entlipidierten Proteinproben mit einem Lyophilisator trocknen. Um die erwartete Bla g 1-Ausbeute zu bestimmen, suspendieren Sie ein lyophilisiertes delipidiertes Testaliquot in fünf Millilitern Umfaltungspuffer. Erhitzen Sie die Mischung in einem 500-Milliliter-Becherglas mit 250 Millilitern Wasser auf 95 Grad Celsius auf einer heißen Platte unter Rühren und intermittierendem Wirbeln.
Halten Sie die Lösung 30 bis 60 Minuten bei 95 Grad, bevor sie das Wasserbad langsam auf Raumtemperatur ausgleichen lässt. Wenn die Lösung abgekühlt ist, geben Sie die geglühte Bla g 1-Lipidmischung durch einen 0,22-Mikron-Spritzenfilter, um Partikel zu entfernen, und verwenden Sie einen neuen Zentrifugalfilter mit einem 10-Kilodalton-Cutoff, um den Austausch des gefilterten Proteins dreimal in PBS zu puffern, um verbleibende freie Fettsäuren und organische Lösungsmittel zu entfernen. Bewerten Sie dann die Proteinkonzentration mit einem Standard-Proteinanalyse-Assay, um die erwartete Ausbeute für die verbleibenden Bla g 1-Aliquoten zu bestimmen.
Um den Apo-Bla g 1 zu rekonstituieren, suspendieren Sie die Bla g 1 Aliquoten in fünf Millilitern Umfaltungspuffer pro Aliquot und glühen die Proben wie gezeigt. Um den Bla g 1 mit Phospholipiden zu beladen, fügen Sie 10 Milligramm der gewünschten Ladung in ein Glasreagenzglas und lösen Sie sich in Chloroform auf und verdampfen Sie das Chloroform zu einem Lipidfilm. Fügen Sie dann PBS in die Tube hinzu, um eine endgültige Phospholipidkonzentration von 20 Millimolar zu erzeugen.
Erhitzen Sie das Phospholipid über die Phasenübergangstemperatur der Lipidladung, um den Lipidfilm zu rehydrieren, und wirbeln Sie, bis die Lösung trüb wird. Fügen Sie dann die Phospho-Lipidladung hinzu, um einen 20-fachen molaren Überschuss an Liganden relativ zu Bla g 1 basierend auf der erwarteten Ausbeute zu erzeugen. Ein Niederschlagsmittel kann sich bilden.
Wirbel zu mischen, bevor das Protein wie gezeigt geglüht wird. Um die Ladungsentfernung oder -beladung durch Phosphor-31 NMR zu bestätigen, verwenden Sie einen Zentrifugalfilter, um die Probe auf mehr als 100 Mikromolaren zu konzentrieren, wie gezeigt. Bereiten Sie Referenzphospholipidproben bekannter Konzentrationen im PBS-Puffer wie angegeben vor und verdünnen Sie die Bla g 1-Endreferenz auf ein Verhältnis von 1:1 mit Cholatpuffer auf ein Gesamtvolumen von etwa 600 Mikrolitern.
Verwenden Sie eine Breitbandsonde, um eindimensionale 31-Phosphor-NMR-Spektren der kollatlösierten Bla g 1-Proben und Referenzphospholipid-Standards zu erfassen, vergleichen Sie die Bla g 1 31 Phosphor-NMR-Spektren mit denen, die für Phospholipid-Referenzproben erhalten wurden, um die Entfernung endogener gebundener Liganden und / oder die Bindung der gewünschten Liganden basierend auf den chemischen Verschiebungen der sichtbaren Peaks zu bestätigen, und vergleichen Sie dann die Spitzenintensität des Bla g 1-Spektrums mit der der Phospholipid-Referenzstandards, um die Bestätigung der vollständigen Bindungsstöchiometrie zu ermöglichen. Mit Hilfe der Affinitätschromatographie kann rekombinanteS GST Bla g 1 leicht auf einen hohen Reinheitsgrad isoliert werden, was eine Ausbeute von zwei bis vier Milligramm pro Liter Zellkultur ergibt. Die Inkubation über Nacht mit TEV-Protease bei vier Grad Celsius reicht aus, um das GST-Tag zu entfernen, wodurch das Endprodukt bei etwa 24 Kilodalton entsteht.
Die Anwendung des Bla g 1 auf eine Umkehrphasen-C18-Säule ergibt ein unverwechselbares Elutionsprofil mit zwei großen Peaks bei 50% Puffer B und einem zweiten großen Peak bei 75% Puffer B.Phosphor-31 NMR-Spektren von Apo-Bla g 1 zeigen keine nachweisbaren Phospholipide. Aus der NMR kann unter Verwendung von Referenzproben bekannter DSPC-Konzentrationen eine Standardkurve erstellt werden. Der Vergleich der phosphorigen 31-Signalintensität, die aus DSPC Bla g 1 erhalten wurde, mit dieser Standardkurve kann verwendet werden, um die Bindungsstöchiometrie der Lipide pro Protein zu erhalten.
Zirkuläre Dichroismusspektren für Apo- und lipidbeladene Bla g 1 zeigen Minima von 220 und 210 Nanometern, was auf eine überwiegend alpha-helikale Struktur hinweist. Zirkuläre Dichroismus-basierte thermische Denaturierungsassays zeigen auch einen kooperativen Verlust der alpha-helikalen Sekundärstruktur, was auf eine gefaltete kugelförmige Domäne hinweist. Darüber hinaus zeigt die Analyse der resultierenden Schmelztemperaturen einen signifikanten Anstieg der nMix-Ligandenbindung, der mit Bla g 1 übereinstimmt, das aus seiner natürlichen Allergenquelle gewonnen wird.
Der Erfolg dieses Protokolls hängt von der Fähigkeit ab, sowohl die begrenzte Löslichkeit hydrophober Liganden als auch die unzugängliche Natur der Bla g 1-Bindungshöhle zu überwinden. Dieses Verfahren legt die Grundlage für immunologische Studien, wie z.B. T-Zellproliferationsassays, um die Wirkung von Lipidliganden auf die Sensibilisierung und die molekularen Mechanismen, durch die dies geschieht, zu bewerten. Durch die Kopplung dieses Verfahrens mit weiteren biophysikalischen Assays haben wir gezeigt, dass die Bindung hydrophober Liganden die Stabilität von Bla g 1 verbessert, mit möglichen nachgelagerten Auswirkungen auf die Epitoperzeugung und Allergenität.
