Birçok alerjen hidrofobik molekülleri bağlar. Bu protokol, bu ligandların tamamen kaldırılmasını ve değiştirilmesini sağlayarak, yapı ve immünojeniklik üzerindeki etkilerini sistematik bir şekilde incelememizi sağlar. Termal tavlama ile birlikte ters fazlı HPLC kullanımının iki avantajı vardır.
Endojen ligandları temizler ve ligandların erişilemeyen bağlama alanlarını açması için çözünür hale yardımcı olur. Alerjenikliğe katkıda bulunan faktörleri belirleyebilirsek, bu faktörlerden kaçınan tedaviler tasarlayabiliriz. Birçok protein, güçlü bir şekilde tutulan ve hem yapıyı hem de işlevi etkileyebilecek lipid ligandlarını bağlar.
Yöntemimiz bu etkileşimlerin sistematik olarak incelenmesini sağlar. Birçok lipid kargosunun sınırlı çözünürlüğü ve erişilebilirliği yükleme işlemini engelleyebilir. Bu ligandları hazırlarken dikkatli olun ve sisteme özgü adaptasyonlara olan ihtiyacı göz önünde bulundurun.
Hidrofobik ve çözünmeyen ligandlarla çalışmak bazı alerji uzmanları ve biyokimyacılar için bir ayarlama olduğundan, örneklerin farklı aşamalarda nasıl göründüğünü görmek yararlı olabilir. İfade ve saflaştırma klonlamadan sonra, toplam hacim iki mililitrenin altına düşürülene kadar bir salıncak kovası rotorunda birden fazla santrifüj için 10 kilodalton moleküler ağırlık kesmeden oluşan bir santrifüj filtre ünitesine 12 mililitre bölünmüş Bla g 1 uygulayın. Elde edilen konsantreyi% 97 tampon A ve% 3 tampon B.Elute Bla g 1 ile dengelenmiş bir C18 ters faz kromatografi sütunu ile donatılmış 250 ila 10 milimetre HPLC sistemine dakikada 1,5 ila 4 mililitre akış hızında yükleyin, tabloda belirtildiği gibi, elüasyon işlemini izlemek için 280 nanometrede floresan emiciyi kullanarak.
Yaklaşık 34 ila 40 dakikadan başlayarak ve% 74'ün üzerindeki bir tampon B konsantrasyonu, her Bla g 1 fraksiyonunun dört mililitresinden fazlasını toplamaz. Aliquot havuza Bla g 1 fraksiyonu cam test tüplerine. Tüpleri parafin filmi ile örtün ve filmi iki delik ile delin.
Daha sonra, numuneleri eksi 80 santigrat derecede bir saat dondurun ve elde edilen lipidlenmiş protein örneklerini kurutmak için bir liyofilzer kullanın. Beklenen Bla g 1 verimini belirlemek için, beş mililitrelik yeniden katlama tamponunda liyofilize edilmiş bir de-lipidated test aliquot'u yeniden askıya alın. Karışımı 250 mililitre su içeren 500 mililitrelik bir beherde, karıştırma ve aralıklı girdap ile sıcak bir tabakta 95 santigrat dereceye ısıtın.
Su banyosunun oda sıcaklığına yavaşça dengede tutulmasına izin vermeden önce çözeltiyi 95 derecede 30 ila 60 dakika tutun. Çözelti soğuduğunda, tavlanmış Bla g 1 lipid karışımını partikül maddeyi çıkarmak için 0,22 mikron şırınga filtresinden geçirin ve filtrelenmiş proteini üç kez PBS'ye tamponla değiştirmek için 10 kilodalton kesmeli yeni bir santrifüj filtre kullanın. Daha sonra, kalan Bla g 1 aliquots için beklenen verimi belirlemek için standart bir protein analizi tahlili kullanarak protein konsantrasyonu değerlendirin.
Apo-Bla g 1'i yeniden oluşturmak için, Bla g 1 aliquots'u beş mililitrelik yeniden katlama tamponunda yeniden askıya alın ve örnekleri gösterildiği gibi tavla. Bla g 1'i fosfolipidlerle yüklemek için, bir cam test tüpüne 10 miligram istediğiniz kargoyu ekleyin ve kloroformda çözün ve bir lipid filmi üretmek için kloroformu buharlaştırın. Daha sonra, 20 milimolar son fosfolipid konsantrasyonu üretmek için tüpe PBS ekleyin.
Lipid filmini yeniden sulandırmak için fosfolipid'i lipid yükünün faz geçiş sıcaklığının üzerinde ısıtın ve çözelti bulanıklanıncaya kadar girdap. Ardından, beklenen verime göre Bla g 1'e göre 20x molar fazla ligand üretmek için fosfon lipid kargosunu ekleyin. Bir çökelme oluşabilir.
Gösterildiği gibi proteini tavlamadan önce karıştırmak için girdap. Fosfor-31 NMR ile kargonun çıkarılmasını veya yüklenmesini onaylamak için, numuneyi gösterildiği gibi 100 mikromolundan daha büyük bir mikromolar'a konsantre etmek için bir santrifüj filtresi kullanın. Belirtildiği gibi PBS tamponunda bilinen konsantrasyonların referans fosfolipid örneklerini hazırlayın ve Bla g 1 uç referansını kolit tamponu ile 1:1 oranına yaklaşık 600 mikrolitrelik toplam hacme seyreltin.
Harmanlanmış Bla g 1 örneklerinin tek boyutlu, 31 fosforlu NMR spektrumunu elde etmek için geniş bant probu kullanın ve fosfolipid standartlarına başvurun, ve Bla g 1 31 fosforlu NMR spektrumtrasını fosfolipid referans örnekleri için elde edilenlerle karşılaştırarak endojen olarak bağlı ligandların çıkarılmasını ve/veya görünür zirvelerin kimyasal kaymalarına dayanarak istenen ligandların bağlanmasını onaylamak, daha sonra Bla g 1 spektrumunun tepe yoğunluğunu fosfolipid referans standartlarınınkiyle karşılaştırarak tam bağlayıcı stoichiometry'nin onaylanmasına izin verin. Benzeşim kromatografisi kullanılarak, rekombinant GST Bla g 1, hücre kültürünün litresi başına iki ila dört miligram verim üreten yüksek saflık seviyesine kolayca izole edilebilir. Tev proteaz ile dört santigrat derecede gece boyunca inkübasyon, GST etiketini çıkarmak için yeterlidir ve nihai ürünü yaklaşık 24 kilodaltonda verir.
Bla g 1'i ters fazlı bir C18 sütununa uygulamak, %50 tampon B'de iki büyük tepe ve Apo-Bla g 1'in %75 tampon B.Fosfor-31 NMR spektrumu ile tespit edilebilir fosfolipidler göstermeyen belirgin bir elüasyon profili sağlar. Bilinen DSPC konsantrasyonlarının referans örnekleri kullanılarak NMR'den standart bir eğri üretilebilir. DSPC Bla g 1'den elde edilen fosfor 31 sinyal yoğunluğunun bu standart eğri ile karşılaştırılması, protein başına lipitlerin bağlayıcı stoichiometry'liğini sağlamak için kullanılabilir.
Apo ve lipid yüklü Bla g 1 için dairesel dikroizm spektrumu, ağırlıklı olarak alfa-sarmal bir yapının göstergesi olan 220 ve 210 nanometrelik minima gösterir. Dairesel dikroizme bazlı termal denatürasyon tahlilleri de katlanmış bir küresel etki alanının göstergesi olan alfa-sarmal ikincil yapının kooperatif kaybını göstermektedir. Ek olarak, ortaya çıkan erime sıcaklıklarının analizi, doğal alerjen kaynağından elde edilen Bla g 1 ile tutarlı olarak nMix ligand bağlamasında önemli bir artış olduğunu ortaya koymaktadır.
Bu protokolün başarısı, hem hidrofobik ligandların sınırlı çözünürlüğünü hem de Bla g 1 bağlama boşluğunun erişilemez doğasının üstesinden gelme yeteneğine dayanmaktadır. Bu prosedür, lipid ligandlarının duyarlılık üzerindeki etkisini ve bunun meydana geldiği moleküler mekanizmaları değerlendirmek için T hücre çoğalması tahlilleri gibi immünolojik çalışmalara zemin hazırlar. Bu prosedürü daha fazla biyofiziksel testle birleştiriyor, hidrofobik ligandların bağlanmasının Bla g 1 stabilitesini artırdığını ve epitop üretimi ve alerjeniklik için potansiyel aşağı akış etkileri olduğunu gösterdik.
