多くのアレルゲンは疎水性分子に結合する。このプロトコルは、これらのリガンドの完全な除去と置換を可能にし、体系的な方法で構造および免疫原性への影響を研究することを可能にする。逆相HPLCの使用は、熱アニーリングと相まって、2つの利点を有する。
それは内因性リガンドを除去し、リガンドを可溶化して他の方法ではアクセスできない結合部位を開くのに役立ちます。アレルゲン性に寄与する要因を特定できれば、これらの要因を避ける治療法を設計できる可能性があります。多くのタンパク質は脂質リガンドに結合し、強固に保持され、構造と機能の両方に影響を与える可能性があります。
我々の方法は、これらの相互作用の体系的な研究を可能にする。多くの脂質貨物の限られた溶解性およびアクセス性は、ローディングプロセスを阻害する可能性がある。これらのリガンドを準備する際には必ず注意を払い、システム特有の適応の必要性を考慮してください。
疎水性および不溶性リガンドの作業は、一部のアレルギー物質や生化学者にとって調整であるため、サンプルが異なる段階でどのようなものであるかを確認するのに役立ちます。発現と精製をクローニングした後、全容が2ミリリットル未満になるまで、スイングバケットローターでの複数の遠心分離のための10キロダルトン分子量カットオフを有する遠心フィルターユニットに、切断されたブラg1の12ミリリットルを適用する。得られた濃縮物を、280ナノメートルの蛍光吸光度を使用して、280ナノメートルの蛍光吸光度を使用して、280ナノメートルの蛍光吸光度を使用して、97%バッファAと3%バッファB.Elute Bla g 1を毎分1.5〜4ミリリットルの流量で平衡にしたC18逆相クロマトグラフィーカラムを装備した250 x 10ミリメートルHPLCシステムに積み込みます。
約34〜40分から始まり、74%を超える緩衝B濃度は、各ブラg1画分の4ミリリットル以下を収集する。アリコートは、ガラス試験管にプールされたBla g 1分数を。パラフィンフィルムでチューブを覆い、2つの穴でフィルムを穿孔します。
次に、サンプルをマイナス80度で1時間凍結し、凍結乾燥機を使用して得られた脂質分解タンパク質サンプルを乾燥させます。予想されるBla g 1収率を決定するために、リフォールディングバッファーの5ミリリットルで凍結乾燥脱脂試験アリコートを再中断する。250ミリリットルの水を含む500ミリリットルのビーカーで混合物を熱し、攪拌と断続的な渦を巻き付けたホットプレートで摂氏95度にします。
水浴を室温にゆっくりと平衡させる前に、溶液を95度に30〜60分間保持します。溶液が冷却されたら、0.22ミクロンのシリンジフィルターを通してアニールされたBla g 1脂質混合物を通過させて粒子状物質を除去し、10キロダルトンカットオフを備えた新しい遠心フィルターを使用して濾過されたタンパク質をPBSに3回バッファー交換し、残留フリー脂肪酸および有機溶媒を除去します。次に、標準的なタンパク質分析アッセイを用いてタンパク質濃度を評価し、残りのBla g 1アリコートの予想収量を決定する。
Apo-Bla g 1を再構成するために、Bla g 1アリコートをアリコート当たり5ミリリットルのリフォールバッファーで再中断し、サンプルをアニールして示すようにする。リン脂質を含むブラg1をロードするには、ガラス試験管に所望の貨物の10ミリグラムを加え、クロロホルムに溶解し、クロロホルムを蒸発させて脂質膜を作製する。次いで、PBSをチューブに加え、20ミリモルの最終的なリン脂質濃度を生成する。
脂質貨物の相転移温度を超えてリン脂質を加熱して脂質膜を水分補給し、溶液が白濁するまで渦を加熱する。次に、リン脂質貨物を加えて、予想される収率に基づいて、Bla g 1に対して20倍のモル過剰のリガンドを生成する。沈殿剤が形成される可能性があります。
デモンストレーションしたようにタンパク質を焼鈍する前に混合する渦。リン-31 NMRによる貨物の取り外しまたは積載を確認するには、遠心フィルタを使用してサンプルを100マイクロモル以上に濃縮します。示されているようにPBSバッファー内の既知の濃度の参照リン脂質サンプルを調製し、約600マイクロリットルの総体積に対して、チョレートバッファーとの1:1の比率に対してBla g 1末端参照を希釈する。
広帯域プローブを使用して、コルレート可溶化ブラg1サンプルの1次元、31リンNMRスペクトルおよびリン脂質標準を参照し、 そして、リン脂質参照サンプルに対して得られたものと、発端的に結合したリガンドの除去および/または可視ピークの化学シフトに基づく所望のリガンドの結合を確認するために得られたものと、Bla g 1スペクトルのピーク強度をリン脂質基準基準と比較して完全結合のシチトトリムを確認できるようにする。アフィニティークロマトグラフィーを使用して、組換えGST Bla g 1は、高い純度に容易に単離することができ、細胞培養の1リットル当たり2〜4ミリグラムの収率を生じる。摂氏4度のTEVプロテアーゼによる一晩のインキュベーションは、GSTタグを除去するのに十分であり、約24キロダルトンで最終製品を得る。
逆相C18カラムにBla g 1を適用すると、50%バッファBで2つの大きなピークを有する独特の溶出プロファイルが得られ、Apo-Bla g 1の75%バッファB.リン-31 NMRスペクトルで2番目の大きなピークは検出可能なリン脂質を示さない。標準曲線は、既知のDSPC濃度の参照サンプルを使用してNMRから生成することができます。DSPC Bla g 1から得られたリン31シグナル強度をこの標準曲線と比較すると、脂質1タンパク質の結合ストイチオメトリーを得ることができる。
アポおよび脂質負荷のBla g 1の円状二色性スペクトルは、主にアルファヘリカル構造を示す220および210ナノメートルのミニマを示す。円形二色性ベースの熱変性アッセイはまた、折り畳まれた球状ドメインを示すα-らせん二次構造の協同組合的損失を示す。さらに、得られた融解温度の分析は、nMixリガンド結合時に有意な増加を明らかにし、その天然アレルゲン源から得られたBla g 1と一致する。
このプロトコルの成功は、疎水性リガンドの限られた溶解性と、Bla g 1結合キャビティのアクセス不能な性質の両方を克服する能力に依存しています。この手順は、T細胞増殖アッセイなどの免疫学的研究の基礎を築き、脂質リガンドが感作に及ぼす影響と、これが起こる分子メカニズムを評価する。この手順をさらなる生物物理学的アッセイと結合すると、疎水性リガンドの結合がBla g 1安定性を高め、エピトープ生成およびアレルゲン性に対する潜在的な下流の影響を有することを示した。
