يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في حاجز الخصية الدموية في حقول البيولوجيا حول المرشحين للجينات أو الفيروسات أو السموم البيئية التي قد تؤثر على وظيفة حاجز الخصية أو السلامة. قبل ثلاثة أيام من الجراحة، علاج ما لا يقل عن ثلاثة ثمانية أسابيع من العمر C57Black/6 الفئران الذكور يوميا مع خمسة ملليغرام لكل كيلوغرام من وزن الجسم الكادميوم كلوريد عن طريق الحقن داخل الصفتون. في يوم الجراحة، ضع نسيجًا نظيفًا على منطقة جراحية معقمة بنسبة 75٪ من الإيثانول، وحدد سخانًا حراريًا إلى 37 درجة مئوية.
وضع الماوس تخدير على الأنسجة، ثم تأكيد عدم وجود استجابة لقرصة إصبع. حلق شعر البطن مع ماكينة حلاقة، وتطهير الجلد المكشوف مع 75٪الإيثانول. إجراء شق جلدي سنتيمتر واحد فوق الغدد السابقة لفضح جدار البطن، واستخدام ملقط صغيرة لرفع الجلد لإجراء شق 0.5 سنتيمتر في الصفاق.
استخدام ملقط للبحث عن منصات الدهون حول epididymis والخصية، وسحب بعناية منصات الدهون إلى فضح واحد الخصية المرفقة. ضع قطعة من الورق تسع سنتيمترات تحت منصات الدهون والخصية، وتحميل ماصات الحقن المجهري مع حل إينولين-FITC المعدة حديثا. قم بتوصيل الماصات بوحدة ميكرومانيبولاتور، واستخدم مجهرًا تشريحيًا لإدراج طرف ماصة الحقن الدقيق بلطف تحت tunica albuginea.
تدوير ببطء ذراع التشغيل لتقديم 20 ميكرولترات من إينولين-FITC في الخلالي من الخصية. إذا كان التسليم ناجحا، سوف تتحول الخصية لون أخضر أصفر مشرق. على الفور إعادة الخصيات إلى تجويف البطن، وحقن الخصية contralateral مع 20 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني، ثم إغلاق الجلد مع خياطة الجراحية.
ووضع الماوس على وسادة الحرارة من سخان الحرارة. بعد 40 دقيقة من الحقن، استخدم مقصًا حادًا لجمع الخصيتين من كل فأر، وغسل الأنسجة في ملليلتر واحد من PBS البارد من الجليد. بعد ذلك، قم بإصلاح الخصيات في 4٪ من الـ paraformaldehyde عند أربع درجات مئوية لمدة 12 إلى 24 ساعة متبوعة بثلاثة غسلات في 1.5 ملليلتر من 1٪ PBS لكل غسل.
بعد 30٪ الجفاف السكروز بين عشية وضحاها، ونقل العينات في إطارات التضمين الفردية، وتغطي الأنسجة مع مجمع درجة حرارة القطع الأمثل. تعيين درجة حرارة التبريد إلى درجة حرارة سالبة 20 درجة مئوية ووضع الإطارات في التبريد لمدة 10 دقائق حتى يتم تجميد أكتوبر. ثم، ملء كل إطار تضمين مع أكتوبر الطازجة حتى يتم تغطية الخصية كلها في كل قالب.
عندما تكون الطبقة الثانية من أكتوبر قد جمدت، والحصول على خمسة ميكرومتر سميكة أقسام عرضية من كل الخصية، والتقاط أقسام الأنسجة على الشرائح المجهر الزجاجي كما يتم الحصول عليها. لتصوير العينات، اسخِن الشرائح أولاً في صندوق مرطب في درجة حرارة الغرفة. بعد 10 دقائق، اغسل الشرائح ثلاث مرات بالملاحي الطازجة المخزنة في تريس في كل غسل، واسمح للقطع بالجفاف لمدة خمس دقائق محمية من الضوء.
استخدام ورق خال من الغبار لإزالة أي المالحة المتبقية، وتركيب العينات مع DAPI الملحقة المتوسطة تصاعد. ثم، تغطية كل عينة مع زلة غطاء مقلوب، وصورة العينات تحت الهدف 20X من المجهر confocal. ثلاثة أيام من العلاج كلوريد الكادميوم يسبب ضررا لحواجز الخصية الدموية مما يسمح inulin-FITC انتشار من المقصورة القاعدية إلى المقصورة apical من ظهارة شبهية.
في المقابل، يتم حظر هذا الانتشار في الخصيات التحكم PBS المعالجة. يتم تحديد مدى الضرر حاجز الخصية الدموية عن طريق حساب نسبة من المسافة من انتشار إينولين -FITC إلى نصف قطر الأنبوب شبهي نفسه. وعلاوة على ذلك، فإن حاجز ال testis الدم سليمة في heterozygous Rictor floxed فئران خروج المغلوب كتل انتشار inulin عبر الحاجز في المقصورة apical، في حين أن الفئران خروج المغلوب ريكتور مشروط تمتلك حاجز الخصية الدم للخطر الذي يسمح نشر إينولين.
أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن نتذكر أن نقدم inulin-FITC المعدة في يوم التجربة والحفاظ على الأنسجة المحمية من الضوء منذ FITC هو جزيء حساس للضوء. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى علاج ضعف تكوين الحيوانات المنوية لأن وظيفة حاجز الخصية الدموية هي توفير بيئة صغيرة متميزة مناعية لإكمال اليونيسيس في تكوين الحيوانات المنوية. بعد تطورها ، توفر هذه التقنية طريقة للباحثين في مجال الطب التناسلي لاستكشاف العقم والعقم في الفئران.
لا تنس أن العمل مع الـ ما قبلات الـمادهياد يمكن أن يكون خطيراً للغاية وأن الاحتياطات مثل ارتداء الملابس وأقنعة الوجه يجب أن تتخذ دائمًا عند إجراء هذا الإجراء.
