نهجين تدفق القياسات الخلوية من NKG2D ليغاند الكشف عن السطح لتمييز الخلايا الجذعية من الخلايا الفرعية السائبة في سرطان الدم النخاعي الحاد

يعرض هذا البروتوكول طريقتين متميزتين للكشف عن NKG2DLs على سطح خلايا AML. توفر هذه التقنية طريقة تلطيخ سريعة وسهلة الاستخدام للكشف عن جميع NKG2DLs المعروفة وربما غير المعروفة. تسمح هذه الطريقة بفصل الخلايا الجذعية اللوكيمية عن خلايا مكافحة غسل الأموال السائبة ، مما يجعل من الممكن زيادة توصيف هذه الخلايا.

ابدأ بإذابة البيوتين وأنابيب بروتين الاندماج NKG2D في درجة حرارة الغرفة. تدور بسرعة أسفل مسحوق FC NKG2D، ثم إضافة 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لإعادة تشكيل مسحوق ومزيج تماما باستخدام P-1000 micropipette. إضافة 100 ميكرولتر من بروتين الانصهار NKG2DL إلى أنبوب البيوتين للحصول على تركيز نهائي من 10 ميكروغرام لكل ملليلتر، وخلط الحل جيدا مع P-100 micropipette.

لإذابة خلايا AML، قم بإزالة المبرد الذي يحتوي على مكافحة غسل الأموال الأولية من تخزين النيتروجين السائل، ووضعه على الفور في حمام مائي 37 درجة مئوية. تحرك بلطف أنبوب ذهابا وإيابا في الماء، مما يسمح لمحتويات القارورة لتذوب حتى لا يكون هناك سوى الكريستال الجليد الصغيرة اليسار. نقل الخلايا المذابة فورا إلى الوسط الذي يحتوي على أنبوب وشطف القارورة باستخدام ملليلتر واحد من المتوسط.

الطرد المركزي الخلايا في 300 مرة G لمدة 10 دقائق والتخلص من supernatant دون إزعاج بيليه. غسل الخلايا مع خمسة ملليلتر من المتوسط RPMI تحتوي على 10٪ FCS وتكرار الطرد المركزي. إعادة إنفاق بيليه الخلية مع العازلة تلطيخ إلى تركيز النهائي من 0.5 مرات 10 إلى الخلايا السابعة لكل ملليلتر.

ثم نقل 100 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى ثقافة الخلية 96 جيدا U-أسفل لوحة والطرد المركزي لوحة في 300 مرة G لمدة 10 دقائق. تجاهل supernatant دون إزعاج بيليه. إعداد مزيج رئيسي من بروتين الاندماج NKG2D البيوتينية بحيث يتم إعادة إنفاق الخلايا في حجم نهائي من 50 ميكرولتر لكل بئر مع تركيز NKG2D النهائي من 10 ميكروغرام لكل ملليلتر لكل بئر.

إضافة مزيج رئيسي أعدت وإعادة إنفاق الكريات الخلية مع ماصة 200 ميكرولتر. احتضان لوحة النصوص والطرد المركزي كما هو موضح في المخطوطة النصية. إعداد مزيج رئيسي باستخدام streptavidin PE بحيث يتم إعادة إنفاق الخلايا في حجم نهائي من 50 ميكرولتر.

إضافة المزيج الرئيسي إلى الخلايا وإعادة إنفاق الكريات مع ماصة متعددة القنوات 300 ميكرولتر. بعد الطرد المركزي لوحة والتخلص من supernatant، استخدم 300 ميكرولتر micropipette متعددة القنوات لإعادة إنفاق الكريات الخلية في 200 ميكرولتر من العازلة تلطيخ بالإضافة إلى 7-AAD. ثم تحليل الخلايا باستخدام جهاز قياس التدفق الخلوي.

عينات مكافحة غسل الأموال التي تم تحليلها إيجابية لCD34 و NKG2DL ، ولكن توجد أيضا مجموعات فرعية سلبية ، مع أربعة مجموعات مختلفة في المجموع. تبدأ استراتيجية التشتيت النموذجية باختيار السكان الرئيسيين للخلايا عبر FSC و SSC. يتم استبعاد Doublets والخلايا الميتة في تحليل المصب.

يتم تعديل البوابات باستخدام ضوابط FMO لضمان تحديد الخلايا الإيجابية بشكل صحيح. يتم تسليط الضوء على كثافة الفلورية للخلايا إيجابية لCD34 مقابل NKG2DL هنا. تظهر خلايا AML الموجبة ل CD34 تعبيرا سطحيا أقل عن NKG2DL ، مما يشير إلى أن تعبير NKG2DL يرتبط بعدم وجود الجذعية.

أظهرت ثلاث عينات أولية من مكافحة غسل الأموال 19.8 و49.8 و89.4٪ أحداث إيجابية لتلطيخ بروتين الانصهار مقابل 20.4 و 50.4 و 90.6٪ لتلطيخ الأجسام المضادة ل NKG2DL المجمعة. من ناحية أخرى ، أظهرت تلطيخ واحد ليغاند مجموعة من الأحداث الإيجابية تصل إلى 92 ٪ مع نسب متفاوتة على أساس ligand. عند محاولة هذا الأسلوب، من المهم جدا أن تكون سريعة عند ذوبان الخلايا AML الأساسية، لأنها هشة ويمكن أن يموت بسهولة خلال هذه الخطوة.

بعد تنفيذ هذا البروتوكول، يمكن إجراء فرز خلية استنادا إلى إشارة NKG2DL لمزيد من التحقيق في المجموعات السكانية.