Bu protokol, AML hücrelerinin yüzeyindeki NKG2DL'leri algılamanın iki farklı yolunu gösterir. Teknik, bilinen ve muhtemelen bilinmeyen tüm NKG2DL'leri tespit etmek için hızlı, kullanıcı dostu bir boyama yöntemi sağlar. Bu yöntem, lösemik kök hücrelerin dökme AML hücrelerinden ayrılmasına izin verir, bu da bu hücrelerin daha fazla karakterize edilerek karakterize edilemeyi mümkün kılar.
Biotin ve NKG2D füzyon protein tüplerini oda sıcaklığında eriterek başlayın. NKG2D FC tozunun altını hızla aşağı çevirin, ardından tozu yeniden inşa etmek ve bir P-1000 mikropipette kullanarak iyice karıştırmak için 500 mikrolitre PBS ekleyin. Mililitre başına 10 mikrogramlık son bir konsantrasyon elde etmek için bir biotin tüpüne 100 mikrolitre NKG2DL füzyon proteini ekleyin ve çözeltiyi bir P-100 mikropipette ile iyice karıştırın.
AML hücrelerini eritmek için, birincil AML içeren cryovial'ı sıvı azot deposundan çıkarın ve hemen 37 santigrat derecelik bir su banyosuna yerleştirin. Tüpü suda hafifçe ileri geri hareket ettirerek şişenin içeriğinin sadece küçük bir buz kristali kalana kadar çözülmesini sağlar. Çözülen hücreleri hemen tüp içeren ortama aktarın ve bir mililitre orta kullanarak şişeyi durulayın.
Hücreleri 10 dakika boyunca 300 kez G'de santrifüjleyin ve peletı bozmadan süpernatantı atın. Hücreleri %10 FCS içeren beş mililitre RPMI ortamıyla yıkayın ve santrifüjü tekrarlayın. Hücre peletini boyama tamponu ile mililitre başına yedinci hücrelere 0,5 çarpı 10 son konsantrasyona yeniden biriktirin.
Daha sonra hücre süspansiyonunun 100 mikrolitresini bir hücre kültürüne aktarın 96 kuyu U-alt plaka ve plakayı 10 dakika boyunca 300 kez G'de santrifüjleyin. Peletin rahatsız etmeden süpernatant atın. Biyotinilasyonlu NKG2D füzyon proteininin ana karışımını hazırlayın, böylece hücreler kuyu başına 50 mikrolitrelik son bir hacimde, kuyu başına mililitre başına 10 mikrogramlık son bir NKG2D konsantrasyonu ile yeniden kullanılır.
Hazırlanan ana karışımı ekleyin ve hücre peletlerini 200 mikroliter pipetle yeniden ıslatın. Metin el yazmasında açıklandığı gibi plakayı kuluçkaya yatırın ve santrifüj edin. Streptavidin PE kullanarak bir ana karışım hazırlayın, böylece hücreler 50 mikrolitrelik son bir hacimde yeniden dirilir.
Ana karışımı hücrelere ekleyin ve peletleri 300 mikroliter çok kanallı pipetle yeniden biriktirin. Plakayı santrifüj ettikten ve süpernatantı attıktan sonra, hücre peletlerini 200 mikrolitrelik boyama tamponu artı 7-AAD'de yeniden kullanmak için 300 mikrolitre çok kanallı bir mikropipette kullanın. Ardından bir akış sitomemetri cihazı kullanarak hücreleri analiz edin.
Analiz edilen AML örnekleri CD34 ve NKG2DL için pozitiftir, ancak toplamda dört farklı popülasyonla negatif alt popülasyonlar da mevcuttur. Tipik gating stratejisi, FSC ve SSC aracılığıyla hücrelerin ana popülasyonunun seçilmesiyle başlar. Aşağı akış analizinde çiftler ve ölü hücreler hariç tutulur.
Kapılar, pozitif hücrelerin doğru tanımlanmasını sağlamak için FDO kontrolleri kullanılarak ayarlanır. CD34 ve NKG2DL için pozitif hücrelerin floresan yoğunlukları burada vurgulanmıştır. CD34 için pozitif olan AML hücreleri, NKG2DL ekspresyonunun sap eksikliği ile ilişkili olduğunu gösteren NKG2DL'nin daha düşük bir yüzey ifadesini gösterir.
Üç primer AML örneği füzyon proteini boyamada 19.8, 49.8 ve %89.4 pozitif olay gösterirken, havuza alınan anti-NKG2DL antikor boyamada %20.4, 50.4 ve %90.6 pozitif olay gösterdi. Öte yandan, tek ligand boyama, ligand'a göre değişen yüzdelerle% 92'ye kadar bir dizi olumlu olay gösterdi. Bu yöntemi denerken, birincil AML hücrelerini çözerken hızlı olmak çok önemlidir, çünkü kırılgandırlar ve bu adım sırasında kolayca ölebilirler.
Bu protokol yapıldıktan sonra, popülasyonları daha fazla araştırmak için NKG2DL sinyaline dayalı bir hücre sıralaması yapılabilir.
