이 프로토콜은 AML 셀 표면에서 NKG2DL을 검출하는 두 가지 뚜렷한 방법을 보여줍니다. 이 기술은 알려진 NKG2DL을 모두 감지하는 빠르고 사용자 친화적인 염색 방법을 제공합니다. 이 방법은 대량 AML 세포에서 백혈병 줄기 세포의 분리를 허용, 이는 더 이러한 세포를 특성화 할 수 있도록.
비오틴과 NKG2D 융합 단백질 튜브를 실온에서 해동하는 것으로 시작합니다. NKG2D FC 파우더를 빠르게 스핀다운한 다음 500마이크로리터의 PBS를 추가하여 분말을 재구성하고 P-1000 마이크로파이프를 사용하여 철저히 혼합합니다. NKG2DL 융합 단백질 100마이크로리터를 비오틴 튜브에 추가하여 밀리리터당 10마이크로그램의 최종 농도를 얻고, P-100 마이크로파이프와 용액을 완전히 혼합합니다.
AML 세포를 해동하려면 액체 질소 저장에서 1 차 AML을 함유하는 극저온을 제거하고 즉시 섭씨 37도의 수조에 놓습니다. 튜브를 물 속앞뒤로 부드럽게 움직여 작은 얼음 결정만 남을 때까지 유리병의 내용물이 해동할 수 있도록 합니다. 해동된 세포를 튜브를 함유하는 배지로 즉시 옮기고 1밀리리터의 배지를 사용하여 바이알을 헹구십시오.
세포를 300배 G에서 10분 동안 원심분리하고 펠릿을 방해하지 않고 상퍼를 버립니다. 10%FCS를 함유한 RPMI 배지 5밀리리터로 세포를 세척하고 원심분리를 반복합니다. 염색 버퍼로 세포 펠릿을 밀리리터당 7번째 세포에 0.5배 10배의 최종 농도로 재차판으로 재차판한다.
그런 다음 셀 현탁액의 100 마이크로리터를 세포 배양(96)에 잘 U-바닥 플레이트로 옮기고 10분 동안 300회 G로 플레이트를 원심분리한다. 펠릿을 방해하지 않고 상체를 버리십시오. 생체화 NKG2D 융합 단백질의 마스터 믹스를 준비하여 세포가 웰당 밀리리터 당 10 마이크로그램의 최종 NKG2D 농도로 잘 혼합된 50 마이크로리터의 최종 부피로 재장매됩니다.
준비된 마스터 믹스를 추가하고 200 마이크로리터 파이펫으로 셀 펠릿을 다시 처리합니다. 텍스트 원고에 설명된 대로 플레이트를 배양하고 원심분리합니다. 세포가 50 마이크로리터의 최종 부피에서 다시 중단되도록 스트렙타비딘 PE를 사용하여 마스터 믹스를 준비합니다.
마스터 믹스를 세포에 추가하고 300 마이크로리터 멀티채널 파이펫으로 펠릿을 다시 처리합니다. 플레이트를 원심분리하고 상체를 폐기한 후, 300 마이크로리터 멀티 채널 마이크로파이프를 사용하여 염색 버퍼 200 마이크로리터와 7-AAD의 세포 펠릿을 재보페한다. 그런 다음 유동 세포측정 장치를 사용하여 세포를 분석합니다.
분석된 AML 샘플은 CD34 및 NKG2DL에 대해 양수이지만 부정적인 하위 집단도 존재하며 총 4개의 서로 다른 집단이 있습니다. 일반적인 게이팅 전략은 FSC 및 SSC를 통해 세포의 주요 인구의 선택으로 시작합니다. 이중 및 죽은 세포는 다운스트림 분석에서 제외됩니다.
게이트는 FMO 컨트롤을 사용하여 조정되어 양수 셀을 적절하게 식별할 수 있습니다. NKG2DL 대 CD34에 대해 양성 세포의 형광 강도가 여기에 강조된다. CD34에 대해 양성인 AML 세포는 NKG2DL의 낮은 표면 발현을 나타내며, 이는 NKG2DL 발현이 줄기 부족과 연관되어 있음을 나타낸다.
3개의 1차 AML 샘플은 풀링된 항NKG2DL 항체 염색에 대해 융합 단백질 염색에 대한 19.8, 49.8 및 89.4%의 양성 발생을 입증하였다. 한편, 단일 리간드 염색은 리간드에 따라 백분율이 달라진 92%까지 다양한 긍정적인 이벤트를 보였다. 이 방법을 시도할 때, 1차 AML 세포를 해동할 때, 깨지기 쉽고 이 단계에서 쉽게 죽을 수 있기 때문에 빠를 것이 매우 중요합니다.
이 프로토콜을 수행한 후 NKG2DL 신호를 기반으로 하는 셀 정렬을 수행하여 인구를 더 자세히 조사할 수 있다.
