Este protocolo muestra dos formas distintas de detectar NKG2DLs en la superficie de las células AML. La técnica proporciona un método de tinción rápido y fácil de usar para detectar todos los NKG2DLs conocidos y posiblemente desconocidos. Este método permite la separación de las células madre leucémicas de las células AML a granel, lo que permite caracterizar aún más estas células.
Comience por descongelar la biotina y los tubos de proteína de fusión NKG2D a temperatura ambiente. Gire rápidamente el polvo NKG2D FC, luego agregue 500 microlitros de PBS para reconstituir el polvo y mezclarlo a fondo usando una micropipeta P-1000. Agregue 100 microlitros de la proteína de fusión NKG2DL a un tubo de biotina para obtener una concentración final de 10 microgramos por mililitro, y mezcle la solución a fondo con una micropipeta P-100.
Para descongelar las células de AML, retire el cryovial que contiene AML primario del almacenamiento de nitrógeno líquido, y colócalo inmediatamente en un baño de agua de 37 grados Celsius. Mueva suavemente el tubo hacia adelante y hacia atrás en el agua, permitiendo que el contenido del vial se descongele hasta que solo quede un pequeño cristal de hielo. Transfiera inmediatamente las células descongeladas al tubo que contiene el medio y enjuague el vial con un mililitro de medio.
Centrifugar las células a 300 veces G durante 10 minutos y desechar el sobrenadante sin molestar el pellet. Lave las células con cinco mililitros de medio RPMI que contenga 10% de FCS y repita la centrifugación. Resuspend la pelotilla de la célula con el almacenador intermediario de la coloración a una concentración final de 0,5 por 10 a las séptimas células por mililitro.
Luego transfiera 100 microlitros de la suspensión celular a una placa de fondo en U de cultivo celular de 96 pozos y centrifugse la placa a 300 veces G durante 10 minutos. Deseche el sobrenadante sin molestar el pellet. Prepare una mezcla maestra de proteína de fusión NKG2D biotinilada para que las células se resuspended en un volumen final de 50 microlitros por pozo con una concentración final de NKG2D de 10 microgramos por mililitro por pozo.
Añadir la mezcla maestra preparada y resuspend los pellets celulares con una pipeta de 200 microlitros. Incubar y centrifugar la placa como se describe en el manuscrito del texto. Prepare una mezcla maestra usando streptavidin PE para que las células se resuspended en un volumen final de 50 microlitros.
Añadir la mezcla maestra a las células y resuspend los pellets con una pipeta multicanal de 300 microlitros. Después de centrifumar la placa y desechar el sobrenadante, utilice una micropipeta multicanal de 300 microlitros para resuspend los pellets celulares en 200 microlitros de tampón de tinción más 7-AAD. A continuación, analice las células utilizando un dispositivo de citometría de flujo.
Las muestras de LMA analizadas son positivas para CD34 y NKG2DL, pero también existen subpoblaciones negativas, con cuatro poblaciones diferentes en total. La estrategia típica de gating comienza con la selección de la población principal de células a través de su FSC y SSC. Los dobletes y las células muertas se excluyen en el análisis aguas abajo.
Las puertas se ajustan utilizando controles FMO para garantizar la identificación adecuada de las células positivas. Las intensidades de fluorescencia de las células positivas para CD34 versus NKG2DL se destacan aquí. Las células AML que son positivas para CD34 muestran una expresión superficial más baja de NKG2DL, lo que indica que la expresión de NKG2DL se asocia con la falta de stemness.
Tres muestras primarias de AML demostraron 19,8, 49,8, y 89,4% eventos positivos para la coloración de la proteína de fusión contra 20,4, 50,4, y 90,6% para la coloración agrupada del anticuerpo anti-NKG2DL. Por otro lado, la tinción de un solo ligando mostró un rango de eventos positivos de hasta el 92% con porcentajes que variaron en función del ligando. Al intentar este método, es muy importante ser rápido al descongelar las células primarias de AML, porque son frágiles y pueden morir fácilmente durante este paso.
Después de realizar este protocolo, se puede realizar una clasificación de células basada en la señal NKG2DL para investigar más a fondo las poblaciones.
