NKG2D 利甘德表面检测的两种流细胞学方法，以区分干细胞与急性骨髓性白血病中的散装亚群

此协议显示了检测 AML 细胞表面 NKG2DL 的两种不同方法。该技术提供了一种快速、用户友好的染色方法，可检测所有已知的、可能未知的 NKG2DL。这种方法允许将白血病干细胞与大宗AML细胞分离，从而有可能进一步描述这些细胞的特征。

首先在室温下解冻生物素和NKG2D融合蛋白管。快速旋转 NKG2D FC 粉末，然后加入 500 微升 PBS 来重组粉末，然后使用 P-1000 微管进行彻底混合。将 NKG2DL 融合蛋白的 100 微升添加到生物素管中，以获得每毫升 10 微克的最终浓度，并将溶液与 P-100 微管彻底混合。

要解冻 AML 细胞，请从液氮储存中取出含有原位 AML 的低温，并立即将其放入 37 摄氏度的水浴中。轻轻地在水中来回移动管子，让小瓶内的内容解冻，直到只剩下一个小冰晶。立即将解冻的细胞转移到含有管子的介质中，然后用一毫升的介质冲洗小瓶。

将细胞以300倍G离心10分钟，并丢弃超高分子，而不会干扰颗粒。用含有10%FCS的5毫升RPMI介质清洗细胞，并重复离心。用染色缓冲器将细胞颗粒重新使用，最终浓度为每毫升0.5倍至7个细胞。

然后将细胞悬浮的 100 微升转移到细胞培养 96 井 U 底板，并以 300 倍 G 离心板 10 分钟。丢弃超高纳特而不干扰颗粒。准备生物素化 NKG2D 融合蛋白的主混合物，使细胞以每口井 50 微升的最终体积进行再利用，最终 NKG2D 浓度为每口井每毫升 10 微克。

加入准备好的主混合物，用200微升移液器重新使用细胞颗粒。如文本手稿中所述，孵化和离心板。使用链球菌素 PE 准备主组合，以便将细胞重新悬念在最终体积为 50 微升。

将主混合物添加到细胞中，然后用 300 微升多通道移液器重新使用颗粒。离心板并丢弃超高纳特后，使用 300 微升多通道微管将细胞颗粒重新用于 200 微升染色缓冲器加 7-AAD。然后使用流细胞学设备分析细胞。

分析的 AML 样本对 CD34 和 NKG2DL 呈阳性，但也存在阴性亚群，总共有四个不同的群体。典型的生长策略从通过 FSC 和 SSC 选择细胞的主要群体开始。下游分析中排除了双细胞和死细胞。

使用 FMO 控制调整闸门，以确保正确识别正细胞。此处突出显示了 CD34 与 NKG2DL 的细胞阳性的荧光强度。对 CD34 呈阳性的 AML 细胞显示 NKG2DL 的较低表面表达，表明 NKG2DL 表达与缺乏干细胞有关。

三个原发性AML样本显示融合蛋白染色阳性事件为19.8、49.8和89.4%，而聚合抗NKG2DL抗体染色为20.4、50.4和90.6%。另一方面，单个配体染色显示一系列阳性事件高达 92%，百分比因配体而异。在尝试此方法时，解冻主要 AML 细胞时快速解冻非常重要，因为它们很脆弱，在步骤中很容易死亡。

执行此协议后，可以执行基于 NKG2DL 信号的细胞排序，以进一步调查该群。