Este protocolo mostra duas maneiras distintas de detectar NKG2DLs na superfície das células AML. A técnica fornece um método de coloração rápido e fácil de usar para detectar todos os NKG2DLs conhecidos e possivelmente desconhecidos. Este método permite a separação de células-tronco leucêmicas de células AML a granel, o que torna possível caracterizar ainda mais essas células.
Comece descongelando a biotina e os tubos de proteína de fusão NKG2D à temperatura ambiente. Gire rapidamente o pó NKG2D FC, depois adicione 500 microliters de PBS para reconstituir o pó e misture completamente usando uma micropipette P-1000. Adicione 100 microliters da proteína de fusão NKG2DL a um tubo de biotina para obter uma concentração final de 10 microgramas por mililitro, e misture a solução completamente com uma micropipette P-100.
Para descongelar as células AML, remova o criovial contendo LMA primária do armazenamento de nitrogênio líquido e coloque-a imediatamente em um banho de água de 37 graus Celsius. Mova suavemente o tubo para frente e para trás na água, permitindo que o conteúdo do frasco descongele até que haja apenas um pequeno cristal de gelo. Transfira imediatamente as células descongeladas para o tubo médio contendo e enxágue o frasco usando um mililitro de meio.
Centrifugar as células a 300 vezes G por 10 minutos e descartar o supernatante sem perturbar a pelota. Lave as células com cinco mililitros de meio RPMI contendo 10% DE FCS e repita a centrifugação. Resuspengem a pelota celular com tampão de coloração a uma concentração final de 0,5 vezes 10 para a sétima célula por mililitro.
Em seguida, transfira 100 microliters da suspensão celular para uma cultura celular 96 bem placa de fundo U e centrifugar a placa a 300 vezes G por 10 minutos. Descarte o supernatante sem perturbar a pelota. Prepare uma mistura mestre de proteína de fusão NKG2D biotinilada para que as células sejam resuspengiadas em um volume final de 50 microliters por poço com uma concentração final de NKG2D de 10 microgramas por mililitro por poço.
Adicione a mistura mestre preparada e resuspenja as pelotas celulares com uma pipeta de 200 microliter. Incubar e centrifugar a placa como descrito no manuscrito do texto. Prepare uma mistura mestra usando streptavidin PE para que as células sejam resuspendidas em um volume final de 50 microliters.
Adicione a mistura mestra às células e resuspenja as pelotas com uma pipeta multicanal de 300 microliter. Depois de centrifugar a placa e descartar o supernascer, use uma micropipette multicanal de 300 microlitrais para resuspencar as pelotas celulares em 200 microliters de tampão de coloração mais 7-AAD. Em seguida, analise as células usando um dispositivo de citometria de fluxo.
As amostras de LMA analisadas são positivas para CD34 e NKG2DL, mas também existem subpopulações negativas, com quatro populações diferentes no total. A estratégia típica de gating começa com a seleção da população principal de células através de seu FSC e SSC. Doublets e células mortas são excluídos na análise a jusante.
Os portões são ajustados usando controles FMO para garantir a identificação adequada das células positivas. As intensidades de fluorescência das células positivas para CD34 versus NKG2DL são destacadas aqui. As células AML positivas para CD34 mostram uma expressão superficial mais baixa de NKG2DL, indicando que a expressão NKG2DL está associada à falta de caule.
Três amostras primárias de LMA demonstraram eventos 19,8, 49,8 e 89,4% positivos para a coloração da proteína de fusão contra 20,4, 50,4 e 90,6% para a coloração de anticorpos anti-NKG2DL agrupadas. Por outro lado, a coloração de ligas simples mostrou uma gama de eventos positivos de até 92%, com os percentuais variando de acordo com o ligante. Ao tentar este método, é muito importante ser rápido ao descongelar as células LMA primárias, pois elas são frágeis e podem morrer facilmente durante esta etapa.
Após a realização deste protocolo, uma espécie de célula baseada no sinal NKG2DL pode ser realizada para investigar melhor as populações.
