تم دعم TO و TD من قبل أرقام منحة JSPS KAKENHI 19H02970 و 20H02999 على التوالي.

1- صيانة مستعمرات المختبرات
<ol><li>لصيانة الأنواع البرية وفئات السكان المتحولة ، استخدم حاوية بلاستيكية كبيرة (460 مم × 360 مم × 170 مم) مع طعام أسماك اصطناعي منتظم ، والمياه في أكواب بلاستيكية مع ثقب تهوية على الجزء العلوي ، وورق مطوي لإخفاء الحشرات ، والقطن ذو الطبقات لوضع البيض (الشكل 2A). الحفاظ على جميع الثقافات المحلية T. داخل حاضنات 37 درجة مئوية وتعيين الرطوبة النسبية (RH) داخل كل حاوية إلى 60٪ -80٪. ملاحظة: لأن T. المحلية تمتص بخار الماء من الغلاف الجوي11،لا حاجة إمدادات المياه المباشرة. يتم الحفاظ على RH المناسبة بسبب وجود بخار الماء من أكواب بلاستيكية تحتوي على ثقب التهوية على الجزء العلوي أو من أكواب بدون غطاء داخل كل حاوية. ليست هناك حاجة لترطيب داخل حاضنة بأكملها التي تحتوي على الثقافات. ويرد في الشكل 1المدة التقريبية لكل مرحلة من مراحل النمو في ظل الحالة الموصوفة في هذا البروتوكول. ويمكن تعديل سرعة النمو عن طريق تغيير درجة الحرارة و / أو RH12.</li>
	<li>إضافة الطعام بشكل دوري. إضافة الماء قبل أن يجف.</li>
	<li>نقل السكان إلى حاوية نظيفة جديدة على الأقل كل 3 أشهر نظرا لأن الكبار التوقف عن وضع البيض في بيئة قذرة و / أو سكان كثيفة (انظر المناقشة).</li>
</ol>2. جمع البيض وصغر الاضاءة
<ol><li>تصميم دليل RNA (GRNA)<ol>
<li>تصميم تسلسل الجيش الملكي النيبالي لكل هدف المطلوبة و BLAST تسلسل GRNA ضد تجميع الجينوم للتحقق من مواقع التعرف على خارج الهدف ممكن.</li>
		<li>توليف وتنقية gRNAs وفقا لتعليمات الشركة المصنعة8. ملاحظة: على سبيل المثال، في حالة استهداف ATP-ملزمة كاسيت الناقل الجين الأبيض، تم تصميم تسلسل الهدف 20 BP واثنين من تخليق الحمض النووي oligonucleotides 5'-TAATACGACTTATAGTAAGTGGTGTGGAC-3' و 5'-TTCCTCTAAAAAACGCCACCAACACTTA-3' تم طلب. تم إعداد قالب الحمض النووي عن طريق تجميع هذين القلة تليها تضخيم البوليستر PCR ثم يتم في المختبر في نسخ من القالب مع بوليميراز T7 RNA.</li>
	</ol></li>
	<li>إعداد مستعمرات جمع البيض<ol>
<li>نقل حوالي 20 من الذكور و 20 أنثى من البالغين إلى حاوية متوسطة الحجم (200 مم × 150 مم × 90 ملم) مع الطعام وإمدادات المياه وورق مطوي وقطعة صغيرة من القطن الطبقات لوضع البيض(الشكل 2B).</li>
		<li>اقامة عدة مستعمرات للحصول على عدد كبير من الاجنة المرحلية في فترة زمنية قصيرة لاستخدامها في تحرير الجينوم. ملاحظة: من المتوقع أن يتم جمع حوالي 20-40 بيضة من مستعمرة بعد 8 ساعات عند 37 درجة مئوية. وعادة ما يستغرق الأمر بضعة أيام للبالغين المنقولين لبدء وضع البيض ، وربما بسبب التكيف مع بيئة جديدة.</li>
	</ol></li>
	<li>في يوم الحقن، استبدل القطن داخل الحاويات بأخرى جديدة.</li>
	<li>ضع شريطًا مزدوج الوجه مقاس 76 مم × 5 مم على شريحة زجاجية عادية مقاس 76 مم × 26 مم.</li>
	<li>بعد ثماني ساعات، وجمع البيض من القطن الطبقات عن طريق فصل الطبقات باستخدام ملقط.</li>
	<li>محاذاة البيض على الشريط على الوجهين باستخدام فرشاة الطلاء الرطب والحفاظ على مسافة 2 مم بين البيض. يجب أن تكون جميع البويضات موجهة بحيث يواجه المحور الطولي للبيضة جانب الحقن (الشكل 3A). اضغط بلطف أسفل البيض مع فرشاة الطلاء لعقد شركة أثناء الحقن. ملاحظة: في هذا البروتوكول، تنمو الفطريات بسرعة في البيض المحقون التالف في حالة رطبة ودافئة. من المهم الحفاظ على المسافة بين البيض لمنع التلوث عبر والتوسع في الفطريات.</li>
	<li>اخلطي بروتينات GRNA و Cas9 إلى تركيز نهائي يبلغ 100 نانوغرام/ميكرولتر و500 نانوغرام/ميكرولتر على التوالي. استخدام الماء المقطر لتخفيف. احتضان المزيج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتعزيز تكوين مجمع ribonucleoprotein ومن ثم الحفاظ على مزيج على الجليد. ملاحظة: يمكن إضافة أحمر محايد بتركيز نهائي بنسبة 1٪ إلى محلول الحقن لمراقبة الكمية المحقونة.</li>
	<li>قم بتحميل 2 ميكرولتر من محلول GRNA/Cas9 في الشعرية الدموية في حقن الزجاج باستخدام أداة تحميل صغيرة. تأكد من عدم وجود فقاعات الهواء في المحلل قبل الحقن. إذا لزم الأمر، اضغط على الإبرة لإزالة الفقاعات. ملاحظة: في هذه التجربة، يتم استخدام إبرة جاهزة للحصول على طرف إبرة دقيقة(الشكل 3B). ويمكن استخدام إبرة محلية الصنع ذات شكل مماثل بدلاً من ذلك.</li>
	<li>إصلاح الشعرية حقن الزجاج، محملة سابقا مع الحل GRNA / Cas9، إلى حامل مجهزة المتلاعب وربط حامل إلى الحقن المجهري الإلكترونية.</li>
	<li>تحسين شكل طرف إبرة عن طريق كسر قليلا مع ملقط لمنع انسداد والحصول على أفضل المتانة في جميع أنحاء سلسلة من الحقن (مثال على إبرة مناسبة يظهر في الشكل 3C). ملاحظة: من المستحسن تغيير إبرة عندما يكون مسدودا. من الممكن الاستمرار في الحقن بنفس الإبرة إذا تم كسرها مرة أخرى مع ملقط ، ولكن تلميحًا أوسع يؤدي إلى مزيد من تلف البيض ويخفض معدل بقائهم على قيد الحياة. كما T. المحلية البيض لينة وهشة، والحفاظ على طرف إبرة غرامة هو المفتاح للحصول على معدل البقاء على قيد الحياة عالية بعد الحقن.</li>
	<li>أدخل الإبرة عند نقطة الوسط للمحور الطولي للبويضة ويحقن كمية طفيفة من المحلل (انظر الشكل 3D-H للرجوع إليه في كمية الحقن). ضبط تكوين الحقن المجهري الإلكترونية أثناء الحقن، اعتمادا على شكل طرف إبرة. ملاحظة: من المستحسن أن تمارس ضغط مستمر أثناء الحقن، وإلا فإن محتويات البيضة اللاصقة يمكن أن تتدفق بسهولة إلى الإبرة الزجاجية وقد تسدها. قد يكون الحل إما لحقن مع نبض ضغط قصير أو مع ضغط مستمر، اعتمادا على كمية السائل حقن. نضع في اعتبارنا أنه عندما تلميح إبرة لديه فتحة واسعة، يتم حقن الكثير من الحل في البيضة، مما يسبب الفتك (الشكل 3F-H). في هذه الحالة ، والحفاظ على تدفق السائل المستمر عن طريق الضغط المستمر ، ثم أدخل الإبرة في البيضة واسحبها على الفور. إذا كان يسبب الكثير من الفيض أو رشقات نارية البيض، وتغيير الإبرة.</li>
	<li>احتفظ بالبويضات المحقونة في حاوية بالحجم المناسب لعدد البيض المحقون (<20 بيضة: طبق صغير؛ >20 بيضة: حاوية متوسطة الحجم) مع 60٪ -80٪ RH و37 درجة مئوية.</li>
</ol>3. التزاوج
<ol><li>تحقق من البيض المحقون بشكل دوري والتخلص من البيض التالف بالملباب لتجنب النمو الفطري(الشكل 3I, J). في حالة الكثير من الفطريات ينمو على البيض، وتنظيف سطح البيض مع ETOH 70٪.</li>
	<li>قبل الفقس (حوالي 10 أيام في 37 درجة مئوية بعد وضع البيض) ، تراجع الشريحة الزجاجية مع البيض المحقون في مسحوق التلك لمعطف سطح الشريط على الوجهين. وهذا سوف تجنب التراص من الحوريات فقست. نقل الشرائح الزجاجية المغلفة بالمسحوق إلى حاوية متوسطة الحجم مع الطعام والماء وورق مطوي لإخفاء الحشرات.</li>
	<li>إزالة الشرائح الزجاجية بعد أن فقست الحوريات. دورياً يتم توفير الطعام حتى يبلغوا سن الرشد. ملاحظة: يستغرق حوالي 2.0-2.5 أشهر للأفراد للوصول إلى مرحلة البلوغ بعد أن يفقس(الشكل 1A). يتم الحكم على مرحلة الكبار على أساس ovipositor متطورة في الإناث(الشكل 1B).</li>
	<li>لمصاحبة الأفراد، ونقل أكبر عدد ممكن من البالغين الإناث من النمط البرية اللازمة من مستعمرة مختبر إلى حاوية متوسطة الحجم واحتضان لهم لمدة 14 يوما على الأقل في 37 درجة مئوية للتأكد من أنهم عذراء. ملاحظة: ليس من الضروري جمع الإناث العذراء من مستعمرة مختبر لأن الكبار T. المحلية لديها دورة متكررة من الزخرد والتزاوج تسمى "دورة الإنجاب والذوبان"، خلالها الإناث رمي الحيوانات المنوية بعيدا مع كل molt والتزاوج مرة أخرى في دورة الإخصاب المقبل13.</li>
	<li>نقل إما ذكر أو أنثى G0 الكبار التي تطورت من البيض حقن و wildtype الكبار (ق) إلى طبق بلاستيكي صغير (Ø 100 مم × 40 مم) مع الغذاء، ورقة مطوية، وقطعة صغيرة من القطن لوضع G1 البيض(الشكل 2C'؛ طبق التزاوج). الحفاظ على أطباق التزاوج في وعاء أكبر مع 60٪ -80٪ RH(الشكل 2C). ملاحظة: يمكن تضمين العديد من البالغين من الأنواع البرية في طبق لزيادة فرصة التزاوج الناجح ، على الرغم من تحقيق معدلات نجاح عالية مع الاقتران واحد إلى واحد.</li>
</ol>4 - جينوتيبينغ
<ol><li>تصميم أزواج التمهيدي PCR لكل رنا لتضخيم منتج 100-200 BP التي تشمل الموقع المستهدف من قبل GRNA. انفجار كل تسلسل التمهيدي ضد تجميع الجينوم للتحقق من خصوصيته (مثال يظهر لاستهداف الجين الأبيض في الشكل 4A).</li>
	<li>تحقق من التحول الجرثومي للبالغين G0.<ol>
<li>بعد خمسة أيام من وضع البيض ، وجمع البيض G1 الفردية من كل زوج G0 الكبار في أنابيب 0.2 مل (بيضة واحدة لكل أنبوب ؛ تخزين العينات التي تم جمعها في -20 درجة مئوية لتخزين على المدى الطويل). فصل طبقات القطن لجمع البيض. ملاحظة: يوصى بالنمط الجيني على الأقل 12 حوريات G1 من كل زوج تزاوج لتقييم نجاح انتقال الخط الجرثومي (انظر نتائج التمثيل).</li>
		<li>أضف 15 ميكرولتر من محلول 0.25 ملغ/مل بروتينيات K (مذاب في مخزن Tris-EDTA) لكل أنبوب، وعينات متجانسة لفترة وجيزة مع المسواك، واحتضان في 55 درجة مئوية لمدة 3 إلى 16 ساعة.</li>
		<li>تعطيل البروتينات K عن طريق وضع العينات في 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.</li>
		<li>إضافة 90 ميكرولتر من الماء المقطر إلى كل أنبوب ويخلط جيدا. استخدم 2 ميكرولتر من الماكر في مزيج تفاعل PCR 10 ميكرولتر يحتوي على ال التمهيديات المصممة في الخطوة 4.1. ملاحظة: يوصى باستخدام بوليميراز الحمض النووي الأمثل للقوالب الخام للوصول إلى ما يكفي من تضخيم البوليميراز البوليميراز.</li>
		<li>لتحليل منتجات PCR ، قم بإجراء مقايسة تنقل heteroduplex (HMA) بنظام كهربائي صغير(الشكل 3B؛ انظر Ohde et al., 2018)8. ملاحظة: يمكن تقييم الطفرات مع طريقتين بديلتين: (1) HMA مع البوليمرات هلام القياسية, مثل 8٪ بولياكريلاميد14; (2) هضم منتجات PCR مع T7 endonuclease تليها agarose هلام الكهربائي15.</li>
		<li>احتفظ فقط بحوريات G1 الناتجة عن البالغين G0 التي تحتوي على طفرات في الخط الجرثومي والتخلص من التشوهات الأخرى.</li>
	</ol></li>
	<li>genotyping الفردية من الحوريات G1 / البالغين<ol>
<li>عزل الحوريات G1 في لوحات 24-جيدا مع التعرق أو فرشاة الطلاء. ضع 24 بئرا في وعاء أكبر (على سبيل المثال، حاوية متوسطة الحجم المستخدمة في هذا البروتوكول) مع إمدادات المياه كما هو موضح أعلاه للحفاظ على RH من 60٪ -80٪(الشكل 1D). الحفاظ على إمدادات الأغذية الأسماك العادية الاصطناعية(الشكل 1D'). ملاحظة: على الرغم من أن هذه الخطوة يمكن أن يؤديها في أي نقطة من مراحل حورية والبالغ, فمن المستحسن لتنفيذ ذلك بعد بلوغ سن البلوغ وقبل الاقتران (> 2.5 أشهر بعد الحقن; الشكل 1B) لأنه من الأسهل للحفاظ على firebrats في وعاء كبير. مطلوب تربية الفردية لتتبع نوع وراثي لكل حورية G1 على الخطوات التالية. G1 الحوريات من نفس G0 الكبار يمكن أن يكون لها طفرات مختلفة.</li>
		<li>قرصة وسحب cerci وceلدال من حورية / الكبار باستخدام ملقط وجمعها في أنبوب 0.2 مل تحتوي على 50 ميكرولتر EtOH (تخزين العينات التي تم جمعها في -20 درجة مئوية لتخزين على المدى الطويل). ملاحظة: يتم جمع عينات الأنسجة في EtOH لأنه يمنع فقدان هذه العينات الصغيرة بسبب الكهرباء الساكنة. إذا كان المرء يحتاج إلى وقف حركة الحشرات ، يُعين الحورية / البالغين على الجليد عند أخذ عينات الأنسجة. لأن T. المحلية لا يمكن البقاء على قيد الحياة بعد التبريد على المدى الطويل على الجليد، لا تخدير لهم لأكثر من دقيقة ونقلها على الفور مرة أخرى إلى درجة حرارة الغرفة. الاجتثاث من cerci وخيوط السد يسبب أي زيادة في الوفيات.</li>
		<li>ضع أنابيب العينة مع الأغطية مفتوحة على كتلة حرارية لمدة 15 دقيقة عند 70 درجة مئوية لتتبخر EtOH.</li>
		<li>كرر الخطوات 4.2.2-4.2.5 لgenotyping.</li>
		<li>إرسال منتجات PCR التي يتم فيها ملاحظة نمط نطاق متحولة إلى خدمة تسلسل سانجر القياسية.</li>
		<li>احتفظ بالحوريات G1/البالغين مع الطفرات المطلوبة وتجاهل الآخرين (انظر الشكل 4C للحصول على نتيجة التسلسل التمثيلي).</li>
	</ol></li>
	<li>عبر البالغين التي تحتوي على الطفرات المطلوبة في طبق التزاوج والحصول على الأجيال القادمة لإنشاء سلالة متحولة homozygous.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Peterson, M. D., Rogers, B. T., Popadi&#263;, A., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+expression+pattern+of+labial,+posterior+homeotic+complex+genes+and+the+teashirt+homologue+in+an+apterygote+insect.">The embryonic expression pattern of labial, posterior homeotic complex genes and the teashirt homologue in an apterygote insect.</a> Development Genes and Evolution. 209, 77-90 (1999).</li><li>Farris, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+organization+of+the+mushroom+bodies+of+Thermobia+domestica+(Zygentoma,+Lepismatidae):+Insights+into+mushroom+body+evolution+from+a+basal+insect.">Developmental organization of the mushroom bodies of Thermobia domestica (Zygentoma, Lepismatidae): Insights into mushroom body evolution from a basal insect.</a> Evolution and Development. 7, 150-159 (2005).</li><li>Kamae, Y., Tanaka, F., Tomioka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+and+functional+analysis+of+the+clock+genes,+Clock+and+cycle,+in+the+firebrat+Thermobia+domestica.">Molecular cloning and functional analysis of the clock genes, Clock and cycle, in the firebrat Thermobia domestica.</a> Journal of Insect Physiology. 56, 1291-1299 (2010).</li><li>Ohde, T., Masumoto, M., Yaginuma, T., Niimi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+RNAi+analysis+in+the+firebrat,+Thermobia+domestica:+Distal-less+is+required+to+form+caudal+filament.">Embryonic RNAi analysis in the firebrat, Thermobia domestica: Distal-less is required to form caudal filament.</a> Journal of Insect Biotechnology and Sericology. 105, 99-105 (2009).</li><li>Ohde, T., Yaginuma, T., Niimi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nymphal+RNAi+analysis+reveals+novel+function+of+scalloped+in+antenna,+cercus+and+caudal+filament+formation+in+the+firebrat,+Thermobia+domestica.">Nymphal RNAi analysis reveals novel function of scalloped in antenna, cercus and caudal filament formation in the firebrat, Thermobia domestica.</a> Journal of Insect Biotechnology and Sericology. 108, 101-108 (2012).</li><li>Bell&#233;s, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+Drosophila:+RNAi+in+vivo+and+functional+genomics+in+insects.">Beyond Drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects.</a> Annual Review of Entomology. 55, 111-128 (2010).</li><li>Ohde, T., Takehana, Y., Shiotsuki, T., Niimi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-based+heritable+targeted+mutagenesis+in+Thermobia+domestica:+A+genetic+tool+in+an+apterygote+development+model+of+wing+evolution.">CRISPR/Cas9-based heritable targeted mutagenesis in Thermobia domestica: A genetic tool in an apterygote development model of wing evolution.</a> Arthropod Structure and Development. 47, 362-369 (2018).</li><li>Nji, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+insects:+Applications,+best+practices+and+biosafety+concerns.">CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns.</a> Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).</li><li>Brand, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+the+odorant+receptor+gene+family+in+insects.">The origin of the odorant receptor gene family in insects.</a> eLife. 7, 1-13 (2018).</li><li>Noble-Nesbitt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+balance+in+the+firebrat,+Thermobia+domestica+(Packard).+Exchanges+of+water+with+the+atmosphere.">Water balance in the firebrat, Thermobia domestica (Packard). Exchanges of water with the atmosphere.</a> Journal of Experimental Biology. 50, 745-769 (1969).</li><li>Sweetman, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+ecology+of+the+firebrat,+Thermobia+domestica+(Packard).">Physical ecology of the firebrat, Thermobia domestica (Packard).</a> Ecological Monographs. 8, 285-311 (1938).</li><li>Nijhout, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Insect Hormones. , (1994).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+detection,+quantification+and+enrichment+of+subtle+allelic+alterations.">Efficient detection, quantification and enrichment of subtle allelic alterations.</a> DNA Research. 19, 423-433 (2012).</li><li>Mashal, R. D., Koontz, J., Sklar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+mutations+by+cleavage+of+DNA+heteroduplexes+with+bacteriophage+resolvases.">Detection of mutations by cleavage of DNA heteroduplexes with bacteriophage resolvases.</a> Nature Genetics. 9, 177-183 (1995).</li><li>Adams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+notes+upon+the+firebrat,+Thermobia+domestica+Packard.">Biological notes upon the firebrat, Thermobia domestica Packard.</a> Journal of the New York Entomological Society. 41, 557-562 (1933).</li></ol>

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

بالنسبة للجيل الناجح من المتحولة T. domestica المرغوب فيها مع CRISPR/Cas9 ، من المهم أولاً جمع عدد كاف من الأجنة المرحلية للحقن. للحصول على مجموعة ثابتة من عدد كاف من البيض المحلي T. ، فإن المفتاح هو تحديد حجم مناسب للحاوية ليكون لها كثافة سكانية أقل لأنها ستساعد على الانتهاء بنجاح من سلسلة م...

ينتمي ثيرامبيا المحلية إلى واحدة من أكثر أوامر الحشرات القاعدية ، Zygentoma ، التي تحتفظ بدورة حياة غير اثيرية وغير جناحية. هذه الحالة الفينوغرافية القاعدية وخصائص الأجداد هذه الأنواع هي نموذج جذاب لدراسة الآليات الكامنة في نجاح الحشرات على الأرض، والتي تغطي أكثر من 70٪ من الأنواع الحيوانية الموصوفة1. T. المحلية منذ فترة طويلة تستخدم أساسا لدراسة خصائص الأجداد من علم وظائف الأعضاء الحشرية بسبب ميزات مناسبة كنموذج مختبري، مثل دورة حياة قصيرة نسبيا (2.5-3.0 أشهر من الجنين إلى البالغين الإنجابية؛ الشكل 1أ) وتربية سهلة. في العقود الثلاثة الماضية، تم توسيع استخدامه للتحقيق في خصائص الأجداد من مختلف الصفات مثل خطة الجسم، والتمايز العصبي، والإيقاعات circadian2،3،4.
ويمكن أن يؤدي تطبيق الأدوات الجينية المتقدمة في مجال ت. محلي() إلى زيادة التعجيل بهذه المساهمات في مجال بحثي واسع. تم الإبلاغ عن التدخل الناجح للرنا (RNAi) -بوساطة الجينات في الأجنة والحوريات والبالغين في T. المحلية4,5,6. لا تزال كفاءة RNAi النظامية تعتمد على الأنواع بشكل كبير - على سبيل المثال ، فهي عالية بشكل عام في coleoptera في حين أنها منخفضة في أمر lepidoptera7. ولم يتم بعد تقييم كفاءة ومدة الضربة القاضية لـ RNAi في T. domestica. بالإضافة إلى RNAi، وقد أبلغنا سابقا ناجحة CRISPR / Cas9-بوساطة الجينات بالضربة القاضية في T. المحلية8. وقد تم تطبيق نظام CRISPR / Cas على نطاق واسع لتحرير الجينوم في الحشرات خاصة بالنسبة للجين المستهدف بالضربة القاضية. ويمكن توسيع استخدامه لتطبيقات أخرى مثل مقايسة مراسل الجينات ، وتتبع نسب الخلية ، والتلاعب في النشاط النسخي عن طريق طرق في المنشآت الخارجية بعد إنشاء بروتوكول لتسليم مكونات نظام CRISPR / Cas في النوى9. جنبا إلى جنب مع الجمعية الجينومالمنشورة 10، والاستخدام على نطاق واسع وزيادة تطوير تحرير الجينوم CRISPR / Cas القائم على CAS في T. المحلية من شأنه أن يسهل الدراسات التي تركز على الآليات التطورية وراء النجاح التكيفي المعلقة للحشرات. هنا، نحن وصف بروتوكول مفصل للجنين microinjection والتزاوج الكبار T. المحلية لتوليد سلالة متحولة باستخدام CRISPR / Cas9. وبالنظر إلى هذه الطريقة الجديدة، فإننا نناقش أهمية النظر في البيولوجيا الفريدة للأنواع النموذجية غير التقليدية للتطبيقات الناجحة لهذه التقنيات.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>83-3738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3, 100 &#181;g</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>1081060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-static cleaner</td>
			<td>Hozan</td>
			<td>Z-292</td>
			<td>for removing static electricity from a 24-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barrier Box 20.7L</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>4-5606-01</td>
			<td>Large container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FemtoJet 4i</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5252000013</td>
			<td>Electronic microinjector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtotip II, injection capillary</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242957000</td>
			<td>Glass injection capillary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Pack 2440mL</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>5-068-25</td>
			<td>Middle-sized container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MIR-554-PJ</td>
			<td>for 37 &#176;C incubation. No need to humidify inside the incubator.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOD Fx Neo</td>
			<td>Toyobo</td>
			<td>KFX-101</td>
			<td>PCR enzyme for genotyping. Optimized for an amplification from crude templates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GJ-8</td>
			<td>for holding the micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MM-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX12</td>
			<td>for microinjection. More than 35X magnification is sufficient for the microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiNA</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>MCE-202</td>
			<td>Microchip electrophoresis system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NiceTac</td>
			<td>Nichiban</td>
			<td>NW-5</td>
			<td>Double-sided tape to place eggs on a glass slide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint brush (horse hair)</td>
			<td>Pentel</td>
			<td>ZBS1-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant culture dish</td>
			<td>SPL Life Sciences</td>
			<td>310100</td>
			<td>Mating dish and water supplies for a large and middle-sized containers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K, recombinant, PCR Grade Lyophilizate from Pichia pastoris</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3115836001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SZX 12 microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX 12</td>
			<td>More than 35X magnification is sufficient for the microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talcum powder</td>
			<td>Maruishi</td>
			<td>877113</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetra Goldfish Gold Growth</td>
			<td>Spectrum Brands</td>
			<td></td>
			<td>Artificial regular fish food</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

egg microinjection and efficient mating for genome editing in the firebrat thermobia domestica

وdybrat ثيرامبيا المحلية هي الأنواع غير المنيع ، الجناح الذي هو مناسبة لدراسة آليات النمو للحشرات التي أدت إلى إشعاعها التطوري الناجح على الأرض. إن تطبيق الأدوات الوراثية مثل تحرير الجينوم هو المفتاح لفهم التغيرات الوراثية المسؤولة عن التحولات التطورية في نهج إيفو ديفو. في هذه المقالة، ونحن وصف البروتوكول الحالي لتوليد والحفاظ على سلالات متحولة من T. المحلية. نحن نبلغ عن طريقة الحقن الجاف ، كبديل لطريقة الحقن الرطب المبلغ عنها ، التي تسمح لنا بالحصول على معدلات بقاء عالية بشكل ثابت في الأجنة المحقونة. كما أننا نبلغ عن بيئة مثالية لتزاوج البالغين والحصول على الأجيال اللاحقة بكفاءة عالية. وتؤكد طريقتنا على أهمية أخذ البيولوجيا الفريدة لكل نوع في الاعتبار للتطبيق الناجح لطرق تحرير الجينوم على الكائنات الحية النموذجية غير التقليدية. ونتنبأ بأن بروتوكولات تحرير الجينوم هذه ستساعد في تنفيذ T. domestica كنموذج مختبري وعلى زيادة تسريع تطوير وتطبيق أدوات جينية مفيدة في هذا النوع.

في أيدينا، يمكن حقن حوالي 100 بيضة بشكل جيد مع الشعيرية حقن واحد عندما يكون لديه تلميح كافية (الشكل 3C). حقن مجمع gRNA/Cas9 ribonucleoprotein في الأجنة داخل أول 8 ساعة بعد وضع البيض النتائج في indels في موقع يستهدف GRNA. وهذا يسبب طفرات البجلية في بعض خلايا الجيل المحقون (G0) وبالتالي يتم الحصول عل?...

Watch this Scientific Journal Video about Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica at JoVE.com

Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

نحن نقدم بروتوكول مفصل لتربية, microinjection من البيض و التزاوج كفاءة من firebrat ثيرامبيا المحلية لتوليد والحفاظ على سلالات متحولة بعد تحرير الجينوم.

البيض Microinjection وكفاءة التزاوج لتحرير الجينوم في Firebrat ثيرامبيا المحلية

The firebrat Thermobia domestica is an ametabolous, wingless species that is suitable for studying the developmental mechanisms of insects that led to ...

egg-microinjection-efficient-mating-for-genome-editing-firebrat

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

4.3K Views.  Kyoto University. نحن نقدم بروتوكول مفصل لتربية, microinjection من البيض و التزاوج كفاءة من firebrat ثيرامبيا المحلية لتوليد والحفاظ على سلالات متحولة بعد تحرير الجينوم.

Video: Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

تحليل الزرد اليرقات الهيكل العظمي النزاهة العضلات مع ايفانز الأزرق صبغ

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus embryos are large, develop externally, and can be easily manipulated by microinjection or surgical procedures. In addition, fate maps have been established for early Xenopus embryos. Targeted microinjection into the individual blastomere that will eventually give rise to an organ or tissue of interest can be used to selectively overexpress or knock down gene expression within this restricted region, decreasing secondary effects in the rest of the developing embryo. In this protocol, we describe how to utilize established Xenopus fate maps to target the developing Xenopus kidney (the pronephros), through microinjection into specific blastomere of 4- and 8-cell embryos. Injection of lineage tracers allows verification of the specific targeting of the injection. After embryos have developed to stage 38 - 40, whole-mount immunostaining is used to visualize pronephric development, and the contribution by targeted cells to the pronephros can be assessed. The same technique can be adapted to target other tissue types in addition to the pronephros.

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

تقنية لاستهداف حقن مكروي إلى البلدان النامية<em&gt; القيطم</em&gt; الكلى

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Identification of Critical Conditions for Immunostaining in the Pea Aphid Embryos: Increasing Tissue Permeability and Decreasing Background Staining

The pea aphid Acyrthosiphon pisum, with a sequenced genome and abundant phenotypic plasticity, has become an emerging model for genomic and developmental studies. Like other aphids, A. pisum propagate rapidly via parthenogenetic viviparous reproduction, where the embryos develop within egg chambers in an assembly-line fashion in the ovariole. Previously we have established a robust platform of whole-mount in situ hybridization allowing detection of mRNA expression in the aphid embryos. For analyzing the expression of protein, though, established protocols for immunostaining the ovarioles of asexual viviparous aphids did not produce satisfactory results. Here we report conditions optimized for increasing tissue permeability and decreasing background staining, both of which were problems when applying established approaches. Optimizations include: (1) incubation of proteinase K (1 &#181;g/ml, 10 min), which was found essential for antibody penetration in mid- and late-stage aphid embryos; (2) replacement of normal goat serum/bovine serum albumin with a blocking reagent supplied by a Digoxigenin (DIG)-based buffer set and (3) application of methanol rather hydrogen peroxide (H2O2) for bleaching endogenous peroxidase; which significantly reduced the background staining in the aphid tissues. These critical conditions optimized for immunostaining will allow effective detection of gene products in the embryos of A. pisum and other aphids.

A protocol of whole-mount immunostaining on aphid embryos is presented, in which critical conditions for decreasing background staining and increasing tissue permeability are addressed. These conditions are specifically developed for effective detection of protein expression in the embryonic tissues of aphids.

تحديد الظروف الحرجة لالمناعية في البازلاء المن الأجنة: زيادة نفاذية الأنسجة وتقليل خلفية تلطيخ

The pea aphid Acyrthosiphon pisum, with a sequenced genome and abundant phenotypic plasticity, has become an emerging model for genomic and developmental ...

Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and behavioral phenotypes. The remarkably diverse phenotypes that have evolved as marine populations adapt to countless freshwater environments, combined with the ability to cross marine and freshwater forms, provide a rare vertebrate system in which genetics can be used to map genomic regions controlling evolved traits. Excellent genomic resources are now available, facilitating molecular genetic dissection of evolved changes. While mapping experiments generate lists of interesting candidate genes, functional genetic manipulations are required to test the roles of these genes. Gene regulation can be studied with transgenic reporter plasmids and BACs integrated into the genome using the Tol2 transposase system. Functions of specific candidate genes and cis-regulatory elements can be assessed by inducing targeted mutations with TALEN and CRISPR/Cas9 genome editing reagents. All methods require introducing nucleic acids into fertilized one-cell stickleback embryos, a task made challenging by the thick chorion of stickleback embryos and the relatively small and thin blastomere. Here, a detailed protocol for microinjection of nucleic acids into stickleback embryos is described for transgenic and genome editing applications to study gene expression and function, as well as techniques to assess the success of transgenesis and recover stable lines.

Transgenic manipulations and genome editing are critical for functionally testing the roles of genes and cis-regulatory elements. Here a detailed microinjection protocol for the generation of genomic modifications (including Tol2-mediated fluorescent reporter transgene constructs, TALENs, and CRISPRs) is presented for the emergent model fish, the threespine stickleback.

Microinjection لTransgenesis والجينوم التحرير في Threespine أبو شوكة

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance to man of conventional invertebrate model systems and the complexity of genomes in vertebrates are critical challenges to modeling human normal and pathological conditions. The chordate Ciona intestinalis is an invertebrate chordate that emerged from a common ancestor with the vertebrates and may represent features at the interface between invertebrates and vertebrates. A common body plan with much simpler cellular and genomic composition should unveil gene regulatory network (GRN) links and functional genomics readouts explaining phenomena in the vertebrate condition. The compact genome of Ciona, a fixed embryonic lineage with few divisions and large cells, combined with versatile community tools foster efficient gene functional analyses in this organism. Here, we present several crucial methods for this promising model organism, which belongs to the closest sister group to vertebrates. We present protocols for transient transgenesis by electroporation, along with microinjection-mediated gene knockdown, which together provide the means to study gene function and genomic regulatory elements. We extend our protocols to provide information on how community databases are utilized for in silico design of gene regulatory or gene functional experiments. An example study demonstrates how novel information can be gained on the interplay, and its quantification, of selected neural factors conserved between Ciona and man. Furthermore, we show examples of differential subcellular localization in embryonic cells, following DNA electroporation in Ciona zygotes. Finally, we discuss the potential of these protocols to be adapted for tissue specific gene interference with emerging gene editing methods. The in vivo approaches in Ciona overcome major shortcomings of classical model organisms in the quest of unraveling conserved mechanisms in the chordate developmental program, relevant to stem cell research, drug discovery, and subsequent clinical application.

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

We present transient transgenesis and gene knockdown in Ciona intestinalis, a chordate sister group to vertebrates, using microinjection and electroporation techniques. Such methods facilitate functional genomics in this simple invertebrate that features rudimentary characteristics of vertebrates, including notochord and head sensory epithelia, and many orthologs of human disease associated genes.

حقن مكروي الجنين و Electroporation في حبلي<em&gt; Ciona المعوية</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

Collection of Post-mating Semen from the Female Reproductive Tract and Measurement of Semen Liquefaction in Mice

In mice, ejaculated semen is deposited in the uterus. After ejaculation, the semen changes consistency from gel-like to watery, a process called liquefaction. In this study, we show how to collect the post-ejaculated semen from the female reproductive tract in a mouse model. First, adult female mice in the estrus stage were housed in a male&#39;s cage overnight. The next morning, copulation was confirmed by the presence of copulatory plug at the vaginal opening. Female mice with copulatory plugs were euthanized, and each reproductive tract was collected as a whole (vagina, uterus, oviducts, ovaries), ensuring a closed system to contain the semen. The reproductive tract was placed in a 1.5 mL microcentrifuge tube, and the vagina was cut off to release the semen into the tube. To ensure maximum semen volume for analysis, toothless forceps were used to squeeze the uterine horns from ovarian end to vaginal end expelling remaining semen. The whole reproductive tract was then discarded. The semen-containing tube was briefly spun down. A 25 &#956;L capillary pipette was placed into the tube at a 180&#176; angle (parallel to the tube wall). The amount of time used to fill the capillary tube to the 25 &#956;L line was recorded. Semen from a proven male breeder usually takes approximately 60-180 s to fill a 25 &#956;L capillary tube. This semen collection technique can also be used in other downstream applications such as sperm imaging and motility analysis.

Semen liquefaction is required for sperm to be liberated from the seminal gel. This study provides the procedures for collecting semen from the female reproductive tract post-coitus, and measuring semen liquefaction time.

جمع بعد التزاوج السائل المنوي من الإناث المسالك التناسلية وقياس لتسييل المني في الفئران

In mice, ejaculated semen is deposited in the uterus. After ejaculation, the semen changes consistency from gel-like to watery, a process called ...

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of cells or tissues in model organisms. These systems contain two components as separate transgenic lines. A driver line expresses a transcriptional activator under the control of tissue-specific promoters/enhancers, and a reporter/effector line harbors a target gene placed downstream to the binding site of the transcription activator. Animals harboring both components induce tissue-specific transactivation of a target gene expression. Precise spatiotemporal expression of the gene in targeted tissues is critical for unbiased interpretation of cell/gene activity. Therefore, developing a method for generating exclusive cell/tissue-specific driver lines is essential. Here we present a method to generate highly tissue-specific targeted expression system by employing a &#34;Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat/CRISPR-associated&#34; (CRISPR/Cas)-based genome editing technique. In this method, the endonuclease Cas9 is targeted by two chimeric guide RNAs (gRNA) to specific sites in the first coding exon of a gene in the Drosophila genome to create double-strand breaks (DSB). Subsequently, using an exogenous donor plasmid containing the transactivator sequence, the cell-autonomous repair machinery enables homology-directed repair (HDR) of the DSB, resulting in precise deletion and replacement of the exon with the transactivator sequence. The knocked-in transactivator is expressed exclusively in cells where the cis-regulatory elements of the replaced gene are functional. The detailed step-by-step protocol presented here for generating a binary transcriptional driver expressed in Drosophila fgf/branchless-producing epithelial/neuronal cells can be adopted for any gene- or tissue-specific expression.

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

Here, we present a method for generating tissue-specific binary transcription systems in Drosophila by replacing the first coding exon of genes with transcription drivers. The CRISPR/Cas9-based method places a transactivator sequence under the endogenous regulation of a replaced gene, and consequently facilitates transctivator expression exclusively in gene-specific spatiotemporal patterns.

استراتيجية فعالة لتوليد النظم الخاصة بالانسجة النسخ ثنائي في المورفولوجية بتحرير الجينوم

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a general challenge in developmental biology research. In the embryonic heart, this can be particularly difficult as regional differences in the expression of transcriptional regulators, paracrine/juxtacrine signaling cues, and hemodynamic force are all known to influence cardiomyocyte maturation. A simplified method to alter a developing cardiomyocyte's molecular and biomechanical microenvironment would, therefore, serve as a powerful technique to examine how local conditions influence cell fate and function. To address this, we have optimized a method to physically transplant juvenile cardiomyocytes into ectopic locations in the heart or the surrounding embryonic tissue. This allows us to examine how microenvironmental conditions influence cardiomyocyte fate transitions at single cell resolution within the intact embryo. Here, we describe a protocol in which embryonic myocytes can be isolated from a variety of cardiac sub-domains, dissociated, fluorescently labeled, and microinjected into host embryos with high precision. Cells can then be directly analyzed in situ using a variety of imaging and histological techniques. This protocol is a powerful alternative to traditional grafting experiments that can be prohibitively difficult in a moving tissue such as the heart. The general outline of this method can also be adapted to a variety of donor tissues and host environments, and its ease of use, low cost, and speed make it a potentially useful application for a variety of developmental studies.

In this method, embryonic cardiac tissues are surgically microdissected, dissociated, fluorescently labeled, and implanted into host embryonic tissues. This provides a platform for studying the individual or tissue level developmental organization under ectopic hemodynamic conditions, and/or altered paracrine/juxtacrine environments.

النظام القائم على microinjection لفي غرس فيفو Cardiomyocytes الجنينية في جنين الطيور

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Human Egg Maturity Assessment and Its Clinical Application

The optimal timing of intracytoplasmic sperm injection (ICSI) is of a serious concern for fertility programs because untimely sperm entry diminishes the egg&#39;s developmental competence. Presence of the first polar body (PB) together with the meiotic spindle indicates completion of the oocyte maturation and the egg&#39;s readiness for fertilization. In clinical practice, it is customary to assume that all oocytes displaying a PB are mature metaphase (MII) oocytes. However, PB extrusion precedes the formation of the bipolar MII spindle. This asynchrony makes the mere presence of PB an unreliable marker of oocyte maturity. Noninvasive spindle imaging using polarized light microscopy (PLM) allows quick and easy inspection of whether the PB-displaying oocyte actually reassembled a meiotic spindle prior to ICSI. Here, we present a standard protocol to perform human egg maturity assessment in the clinical laboratory. We also show how to optimize the time of ICSI with respect to the oocyte&#39;s developmental stage in order to prevent premature sperm injection of late-maturing oocytes. Using this approach, even immature oocytes extruding PB in vitro can be clinically utilized. Affirmation that MII spindle is present prior to sperm injection and individual adjustment of the time of ICSI is particularly important in poor prognosis in-vitro fertilization (IVF) cycles with a low number of oocytes available for fertilization.

We provide an outline of the clinical protocol for non-invasive assessment of human egg maturity using polarized light microscopy.

تقييم نضج البويضة البشرية وتطبيقها السريري

The optimal timing of intracytoplasmic sperm injection (ICSI) is of a serious concern for fertility programs because untimely sperm entry diminishes the ...

Brain Organoid Generation from Induced Pluripotent Stem Cells in Home-Made Mini Bioreactors

The iPSC-derived brain organoid is a promising technology for in vitro modeling the pathologies of the nervous system and drug screening. This technology has emerged recently. It is still in its infancy and has some limitations unsolved yet. The current protocols do not allow obtaining organoids to be consistent enough for drug discovery and preclinical studies. The maturation of organoids can take up to a year, pushing the researchers to launch multiple differentiation processes simultaneously. It imposes additional costs for the laboratory in terms of space and equipment. In addition, brain organoids often have a necrotic zone in the center, which suffers from nutrient and oxygen deficiency. Hence, most current protocols use a circulating system for culture medium to improve nutrition.
Meanwhile, there are no inexpensive dynamic systems or bioreactors for organoid cultivation. This paper describes a protocol for producing brain organoids in compact and inexpensive home-made mini bioreactors. This protocol allows obtaining high quality organoids in large quantities.

Here we describe a protocol for generating brain organoids from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). To obtain brain organoids in large quantities and of high quality, we use home-made mini bioreactors.

توليد عضوي الدماغ من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات في المفاعلات الحيوية المصغرة المصنوعة منزليا

The iPSC-derived brain organoid is a promising technology for in vitro modeling the pathologies of the nervous system and drug screening. This technology ...