تم دعم TO و TD من قبل أرقام منحة JSPS KAKENHI 19H02970 و 20H02999 على التوالي.

1- صيانة مستعمرات المختبرات
<ol><li>لصيانة الأنواع البرية وفئات السكان المتحولة ، استخدم حاوية بلاستيكية كبيرة (460 مم × 360 مم × 170 مم) مع طعام أسماك اصطناعي منتظم ، والمياه في أكواب بلاستيكية مع ثقب تهوية على الجزء العلوي ، وورق مطوي لإخفاء الحشرات ، والقطن ذو الطبقات لوضع البيض (الشكل 2A). الحفاظ على جميع الثقافات المحلية T. داخل حاضنات 37 درجة مئوية وتعيين الرطوبة النسبية (RH) داخل كل حاوية إلى 60٪ -80٪. ملاحظة: لأن T. المحلية تمتص بخار الماء من الغلاف الجوي11،لا حاجة إمدادات المياه المباشرة. يتم الحفاظ على RH المناسبة بسبب وجود بخار الماء من أكواب بلاستيكية تحتوي على ثقب التهوية على الجزء العلوي أو من أكواب بدون غطاء داخل كل حاوية. ليست هناك حاجة لترطيب داخل حاضنة بأكملها التي تحتوي على الثقافات. ويرد في الشكل 1المدة التقريبية لكل مرحلة من مراحل النمو في ظل الحالة الموصوفة في هذا البروتوكول. ويمكن تعديل سرعة النمو عن طريق تغيير درجة الحرارة و / أو RH12.</li>
	<li>إضافة الطعام بشكل دوري. إضافة الماء قبل أن يجف.</li>
	<li>نقل السكان إلى حاوية نظيفة جديدة على الأقل كل 3 أشهر نظرا لأن الكبار التوقف عن وضع البيض في بيئة قذرة و / أو سكان كثيفة (انظر المناقشة).</li>
</ol>2. جمع البيض وصغر الاضاءة
<ol><li>تصميم دليل RNA (GRNA)<ol>
<li>تصميم تسلسل الجيش الملكي النيبالي لكل هدف المطلوبة و BLAST تسلسل GRNA ضد تجميع الجينوم للتحقق من مواقع التعرف على خارج الهدف ممكن.</li>
		<li>توليف وتنقية gRNAs وفقا لتعليمات الشركة المصنعة8. ملاحظة: على سبيل المثال، في حالة استهداف ATP-ملزمة كاسيت الناقل الجين الأبيض، تم تصميم تسلسل الهدف 20 BP واثنين من تخليق الحمض النووي oligonucleotides 5'-TAATACGACTTATAGTAAGTGGTGTGGAC-3' و 5'-TTCCTCTAAAAAACGCCACCAACACTTA-3' تم طلب. تم إعداد قالب الحمض النووي عن طريق تجميع هذين القلة تليها تضخيم البوليستر PCR ثم يتم في المختبر في نسخ من القالب مع بوليميراز T7 RNA.</li>
	</ol></li>
	<li>إعداد مستعمرات جمع البيض<ol>
<li>نقل حوالي 20 من الذكور و 20 أنثى من البالغين إلى حاوية متوسطة الحجم (200 مم × 150 مم × 90 ملم) مع الطعام وإمدادات المياه وورق مطوي وقطعة صغيرة من القطن الطبقات لوضع البيض(الشكل 2B).</li>
		<li>اقامة عدة مستعمرات للحصول على عدد كبير من الاجنة المرحلية في فترة زمنية قصيرة لاستخدامها في تحرير الجينوم. ملاحظة: من المتوقع أن يتم جمع حوالي 20-40 بيضة من مستعمرة بعد 8 ساعات عند 37 درجة مئوية. وعادة ما يستغرق الأمر بضعة أيام للبالغين المنقولين لبدء وضع البيض ، وربما بسبب التكيف مع بيئة جديدة.</li>
	</ol></li>
	<li>في يوم الحقن، استبدل القطن داخل الحاويات بأخرى جديدة.</li>
	<li>ضع شريطًا مزدوج الوجه مقاس 76 مم × 5 مم على شريحة زجاجية عادية مقاس 76 مم × 26 مم.</li>
	<li>بعد ثماني ساعات، وجمع البيض من القطن الطبقات عن طريق فصل الطبقات باستخدام ملقط.</li>
	<li>محاذاة البيض على الشريط على الوجهين باستخدام فرشاة الطلاء الرطب والحفاظ على مسافة 2 مم بين البيض. يجب أن تكون جميع البويضات موجهة بحيث يواجه المحور الطولي للبيضة جانب الحقن (الشكل 3A). اضغط بلطف أسفل البيض مع فرشاة الطلاء لعقد شركة أثناء الحقن. ملاحظة: في هذا البروتوكول، تنمو الفطريات بسرعة في البيض المحقون التالف في حالة رطبة ودافئة. من المهم الحفاظ على المسافة بين البيض لمنع التلوث عبر والتوسع في الفطريات.</li>
	<li>اخلطي بروتينات GRNA و Cas9 إلى تركيز نهائي يبلغ 100 نانوغرام/ميكرولتر و500 نانوغرام/ميكرولتر على التوالي. استخدام الماء المقطر لتخفيف. احتضان المزيج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتعزيز تكوين مجمع ribonucleoprotein ومن ثم الحفاظ على مزيج على الجليد. ملاحظة: يمكن إضافة أحمر محايد بتركيز نهائي بنسبة 1٪ إلى محلول الحقن لمراقبة الكمية المحقونة.</li>
	<li>قم بتحميل 2 ميكرولتر من محلول GRNA/Cas9 في الشعرية الدموية في حقن الزجاج باستخدام أداة تحميل صغيرة. تأكد من عدم وجود فقاعات الهواء في المحلل قبل الحقن. إذا لزم الأمر، اضغط على الإبرة لإزالة الفقاعات. ملاحظة: في هذه التجربة، يتم استخدام إبرة جاهزة للحصول على طرف إبرة دقيقة(الشكل 3B). ويمكن استخدام إبرة محلية الصنع ذات شكل مماثل بدلاً من ذلك.</li>
	<li>إصلاح الشعرية حقن الزجاج، محملة سابقا مع الحل GRNA / Cas9، إلى حامل مجهزة المتلاعب وربط حامل إلى الحقن المجهري الإلكترونية.</li>
	<li>تحسين شكل طرف إبرة عن طريق كسر قليلا مع ملقط لمنع انسداد والحصول على أفضل المتانة في جميع أنحاء سلسلة من الحقن (مثال على إبرة مناسبة يظهر في الشكل 3C). ملاحظة: من المستحسن تغيير إبرة عندما يكون مسدودا. من الممكن الاستمرار في الحقن بنفس الإبرة إذا تم كسرها مرة أخرى مع ملقط ، ولكن تلميحًا أوسع يؤدي إلى مزيد من تلف البيض ويخفض معدل بقائهم على قيد الحياة. كما T. المحلية البيض لينة وهشة، والحفاظ على طرف إبرة غرامة هو المفتاح للحصول على معدل البقاء على قيد الحياة عالية بعد الحقن.</li>
	<li>أدخل الإبرة عند نقطة الوسط للمحور الطولي للبويضة ويحقن كمية طفيفة من المحلل (انظر الشكل 3D-H للرجوع إليه في كمية الحقن). ضبط تكوين الحقن المجهري الإلكترونية أثناء الحقن، اعتمادا على شكل طرف إبرة. ملاحظة: من المستحسن أن تمارس ضغط مستمر أثناء الحقن، وإلا فإن محتويات البيضة اللاصقة يمكن أن تتدفق بسهولة إلى الإبرة الزجاجية وقد تسدها. قد يكون الحل إما لحقن مع نبض ضغط قصير أو مع ضغط مستمر، اعتمادا على كمية السائل حقن. نضع في اعتبارنا أنه عندما تلميح إبرة لديه فتحة واسعة، يتم حقن الكثير من الحل في البيضة، مما يسبب الفتك (الشكل 3F-H). في هذه الحالة ، والحفاظ على تدفق السائل المستمر عن طريق الضغط المستمر ، ثم أدخل الإبرة في البيضة واسحبها على الفور. إذا كان يسبب الكثير من الفيض أو رشقات نارية البيض، وتغيير الإبرة.</li>
	<li>احتفظ بالبويضات المحقونة في حاوية بالحجم المناسب لعدد البيض المحقون (<20 بيضة: طبق صغير؛ >20 بيضة: حاوية متوسطة الحجم) مع 60٪ -80٪ RH و37 درجة مئوية.</li>
</ol>3. التزاوج
<ol><li>تحقق من البيض المحقون بشكل دوري والتخلص من البيض التالف بالملباب لتجنب النمو الفطري(الشكل 3I, J). في حالة الكثير من الفطريات ينمو على البيض، وتنظيف سطح البيض مع ETOH 70٪.</li>
	<li>قبل الفقس (حوالي 10 أيام في 37 درجة مئوية بعد وضع البيض) ، تراجع الشريحة الزجاجية مع البيض المحقون في مسحوق التلك لمعطف سطح الشريط على الوجهين. وهذا سوف تجنب التراص من الحوريات فقست. نقل الشرائح الزجاجية المغلفة بالمسحوق إلى حاوية متوسطة الحجم مع الطعام والماء وورق مطوي لإخفاء الحشرات.</li>
	<li>إزالة الشرائح الزجاجية بعد أن فقست الحوريات. دورياً يتم توفير الطعام حتى يبلغوا سن الرشد. ملاحظة: يستغرق حوالي 2.0-2.5 أشهر للأفراد للوصول إلى مرحلة البلوغ بعد أن يفقس(الشكل 1A). يتم الحكم على مرحلة الكبار على أساس ovipositor متطورة في الإناث(الشكل 1B).</li>
	<li>لمصاحبة الأفراد، ونقل أكبر عدد ممكن من البالغين الإناث من النمط البرية اللازمة من مستعمرة مختبر إلى حاوية متوسطة الحجم واحتضان لهم لمدة 14 يوما على الأقل في 37 درجة مئوية للتأكد من أنهم عذراء. ملاحظة: ليس من الضروري جمع الإناث العذراء من مستعمرة مختبر لأن الكبار T. المحلية لديها دورة متكررة من الزخرد والتزاوج تسمى "دورة الإنجاب والذوبان"، خلالها الإناث رمي الحيوانات المنوية بعيدا مع كل molt والتزاوج مرة أخرى في دورة الإخصاب المقبل13.</li>
	<li>نقل إما ذكر أو أنثى G0 الكبار التي تطورت من البيض حقن و wildtype الكبار (ق) إلى طبق بلاستيكي صغير (Ø 100 مم × 40 مم) مع الغذاء، ورقة مطوية، وقطعة صغيرة من القطن لوضع G1 البيض(الشكل 2C'؛ طبق التزاوج). الحفاظ على أطباق التزاوج في وعاء أكبر مع 60٪ -80٪ RH(الشكل 2C). ملاحظة: يمكن تضمين العديد من البالغين من الأنواع البرية في طبق لزيادة فرصة التزاوج الناجح ، على الرغم من تحقيق معدلات نجاح عالية مع الاقتران واحد إلى واحد.</li>
</ol>4 - جينوتيبينغ
<ol><li>تصميم أزواج التمهيدي PCR لكل رنا لتضخيم منتج 100-200 BP التي تشمل الموقع المستهدف من قبل GRNA. انفجار كل تسلسل التمهيدي ضد تجميع الجينوم للتحقق من خصوصيته (مثال يظهر لاستهداف الجين الأبيض في الشكل 4A).</li>
	<li>تحقق من التحول الجرثومي للبالغين G0.<ol>
<li>بعد خمسة أيام من وضع البيض ، وجمع البيض G1 الفردية من كل زوج G0 الكبار في أنابيب 0.2 مل (بيضة واحدة لكل أنبوب ؛ تخزين العينات التي تم جمعها في -20 درجة مئوية لتخزين على المدى الطويل). فصل طبقات القطن لجمع البيض. ملاحظة: يوصى بالنمط الجيني على الأقل 12 حوريات G1 من كل زوج تزاوج لتقييم نجاح انتقال الخط الجرثومي (انظر نتائج التمثيل).</li>
		<li>أضف 15 ميكرولتر من محلول 0.25 ملغ/مل بروتينيات K (مذاب في مخزن Tris-EDTA) لكل أنبوب، وعينات متجانسة لفترة وجيزة مع المسواك، واحتضان في 55 درجة مئوية لمدة 3 إلى 16 ساعة.</li>
		<li>تعطيل البروتينات K عن طريق وضع العينات في 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.</li>
		<li>إضافة 90 ميكرولتر من الماء المقطر إلى كل أنبوب ويخلط جيدا. استخدم 2 ميكرولتر من الماكر في مزيج تفاعل PCR 10 ميكرولتر يحتوي على ال التمهيديات المصممة في الخطوة 4.1. ملاحظة: يوصى باستخدام بوليميراز الحمض النووي الأمثل للقوالب الخام للوصول إلى ما يكفي من تضخيم البوليميراز البوليميراز.</li>
		<li>لتحليل منتجات PCR ، قم بإجراء مقايسة تنقل heteroduplex (HMA) بنظام كهربائي صغير(الشكل 3B؛ انظر Ohde et al., 2018)8. ملاحظة: يمكن تقييم الطفرات مع طريقتين بديلتين: (1) HMA مع البوليمرات هلام القياسية, مثل 8٪ بولياكريلاميد14; (2) هضم منتجات PCR مع T7 endonuclease تليها agarose هلام الكهربائي15.</li>
		<li>احتفظ فقط بحوريات G1 الناتجة عن البالغين G0 التي تحتوي على طفرات في الخط الجرثومي والتخلص من التشوهات الأخرى.</li>
	</ol></li>
	<li>genotyping الفردية من الحوريات G1 / البالغين<ol>
<li>عزل الحوريات G1 في لوحات 24-جيدا مع التعرق أو فرشاة الطلاء. ضع 24 بئرا في وعاء أكبر (على سبيل المثال، حاوية متوسطة الحجم المستخدمة في هذا البروتوكول) مع إمدادات المياه كما هو موضح أعلاه للحفاظ على RH من 60٪ -80٪(الشكل 1D). الحفاظ على إمدادات الأغذية الأسماك العادية الاصطناعية(الشكل 1D'). ملاحظة: على الرغم من أن هذه الخطوة يمكن أن يؤديها في أي نقطة من مراحل حورية والبالغ, فمن المستحسن لتنفيذ ذلك بعد بلوغ سن البلوغ وقبل الاقتران (> 2.5 أشهر بعد الحقن; الشكل 1B) لأنه من الأسهل للحفاظ على firebrats في وعاء كبير. مطلوب تربية الفردية لتتبع نوع وراثي لكل حورية G1 على الخطوات التالية. G1 الحوريات من نفس G0 الكبار يمكن أن يكون لها طفرات مختلفة.</li>
		<li>قرصة وسحب cerci وceلدال من حورية / الكبار باستخدام ملقط وجمعها في أنبوب 0.2 مل تحتوي على 50 ميكرولتر EtOH (تخزين العينات التي تم جمعها في -20 درجة مئوية لتخزين على المدى الطويل). ملاحظة: يتم جمع عينات الأنسجة في EtOH لأنه يمنع فقدان هذه العينات الصغيرة بسبب الكهرباء الساكنة. إذا كان المرء يحتاج إلى وقف حركة الحشرات ، يُعين الحورية / البالغين على الجليد عند أخذ عينات الأنسجة. لأن T. المحلية لا يمكن البقاء على قيد الحياة بعد التبريد على المدى الطويل على الجليد، لا تخدير لهم لأكثر من دقيقة ونقلها على الفور مرة أخرى إلى درجة حرارة الغرفة. الاجتثاث من cerci وخيوط السد يسبب أي زيادة في الوفيات.</li>
		<li>ضع أنابيب العينة مع الأغطية مفتوحة على كتلة حرارية لمدة 15 دقيقة عند 70 درجة مئوية لتتبخر EtOH.</li>
		<li>كرر الخطوات 4.2.2-4.2.5 لgenotyping.</li>
		<li>إرسال منتجات PCR التي يتم فيها ملاحظة نمط نطاق متحولة إلى خدمة تسلسل سانجر القياسية.</li>
		<li>احتفظ بالحوريات G1/البالغين مع الطفرات المطلوبة وتجاهل الآخرين (انظر الشكل 4C للحصول على نتيجة التسلسل التمثيلي).</li>
	</ol></li>
	<li>عبر البالغين التي تحتوي على الطفرات المطلوبة في طبق التزاوج والحصول على الأجيال القادمة لإنشاء سلالة متحولة homozygous.</li>
</ol>

<ol><li>Species 2000, ITIS Catalogue of Life, 2019 Annual Checklist. Roskov, Y., et al. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.catalogueoflife.org/annual-checklist/2019">http://www.catalogueoflife.org/annual-checklist/2019</a> (2019).</li>
<li>Peterson, M. D., Rogers, B. T., Popadić, A., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+embryonic+expression+pattern+of+labial%2C+posterior+homeotic+complex+genes+and+the+teashirt+homologue+in+an+apterygote+insect%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Genes+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">The embryonic expression pattern of labial, posterior homeotic complex genes and the teashirt homologue in an apterygote insect.</a> Development Genes and Evolution. 209, 77-90 (1999).</li>
<li>Farris, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+organization+of+the+mushroom+bodies+of+Thermobia+domestica+%28Zygentoma%2C+Lepismatidae%29%3A+Insights+into+mushroom+body+evolution+from+a+basal+insect%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution+and+Development%22%5BJournal%5D)">Developmental organization of the mushroom bodies of Thermobia domestica (Zygentoma, Lepismatidae): Insights into mushroom body evolution from a basal insect.</a> Evolution and Development. 7, 150-159 (2005).</li>
<li>Kamae, Y., Tanaka, F., Tomioka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+and+functional+analysis+of+the+clock+genes%2C+Clock+and+cycle%2C+in+the+firebrat+Thermobia+domestica%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning and functional analysis of the clock genes, Clock and cycle, in the firebrat Thermobia domestica.</a> Journal of Insect Physiology. 56, 1291-1299 (2010).</li>
<li>Ohde, T., Masumoto, M., Yaginuma, T., Niimi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+RNAi+analysis+in+the+firebrat%2C+Thermobia+domestica%3A+Distal-less+is+required+to+form+caudal+filament%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Biotechnology+and+Sericology%22%5BJournal%5D)">Embryonic RNAi analysis in the firebrat, Thermobia domestica: Distal-less is required to form caudal filament.</a> Journal of Insect Biotechnology and Sericology. 105, 99-105 (2009).</li>
<li>Ohde, T., Yaginuma, T., Niimi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nymphal+RNAi+analysis+reveals+novel+function+of+scalloped+in+antenna%2C+cercus+and+caudal+filament+formation+in+the+firebrat%2C+Thermobia+domestica%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Biotechnology+and+Sericology%22%5BJournal%5D)">Nymphal RNAi analysis reveals novel function of scalloped in antenna, cercus and caudal filament formation in the firebrat, Thermobia domestica.</a> Journal of Insect Biotechnology and Sericology. 108, 101-108 (2012).</li>
<li>Bellés, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+Drosophila%3A+RNAi+in+vivo+and+functional+genomics+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Beyond Drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects.</a> Annual Review of Entomology. 55, 111-128 (2010).</li>
<li>Ohde, T., Takehana, Y., Shiotsuki, T., Niimi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-based+heritable+targeted+mutagenesis+in+Thermobia+domestica%3A+A+genetic+tool+in+an+apterygote+development+model+of+wing+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Arthropod+Structure+and+Development%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-based heritable targeted mutagenesis in Thermobia domestica: A genetic tool in an apterygote development model of wing evolution.</a> Arthropod Structure and Development. 47, 362-369 (2018).</li>
<li>Nji, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+in+insects%3A+Applications%2C+best+practices+and+biosafety+concerns%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns.</a> Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).</li>
<li>Brand, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+the+odorant+receptor+gene+family+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">The origin of the odorant receptor gene family in insects.</a> eLife. 7, 1-13 (2018).</li>
<li>Noble-Nesbitt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Water+balance+in+the+firebrat%2C+Thermobia+domestica+%28Packard%29.+Exchanges+of+water+with+the+atmosphere%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Water balance in the firebrat, Thermobia domestica (Packard). Exchanges of water with the atmosphere.</a> Journal of Experimental Biology. 50, 745-769 (1969).</li>
<li>Sweetman, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+ecology+of+the+firebrat%2C+Thermobia+domestica+%28Packard%29%5BTitle%5D)+AND+%22Ecological+Monographs%22%5BJournal%5D)">Physical ecology of the firebrat, Thermobia domestica (Packard).</a> Ecological Monographs. 8, 285-311 (1938).</li>
<li>Nijhout, H. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNijhout%2C+HF+%22Insect+Hormones%22">Insect Hormones</a>. , Princeton University Press. Princeton, NJ. (1994).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+detection%2C+quantification+and+enrichment+of+subtle+allelic+alterations%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Research%22%5BJournal%5D)">Efficient detection, quantification and enrichment of subtle allelic alterations.</a> DNA Research. 19, 423-433 (2012).</li>
<li>Mashal, R. D., Koontz, J., Sklar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+mutations+by+cleavage+of+DNA+heteroduplexes+with+bacteriophage+resolvases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Detection of mutations by cleavage of DNA heteroduplexes with bacteriophage resolvases.</a> Nature Genetics. 9, 177-183 (1995).</li>
<li>Adams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+notes+upon+the+firebrat%2C+Thermobia+domestica+Packard%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+New+York+Entomological+Society%22%5BJournal%5D)">Biological notes upon the firebrat, Thermobia domestica Packard.</a> Journal of the New York Entomological Society. 41, 557-562 (1933).</li>
</ol>

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

بالنسبة للجيل الناجح من المتحولة T. domestica المرغوب فيها مع CRISPR/Cas9 ، من المهم أولاً جمع عدد كاف من الأجنة المرحلية للحقن. للحصول على مجموعة ثابتة من عدد كاف من البيض المحلي T. ، فإن المفتاح هو تحديد حجم مناسب للحاوية ليكون لها كثافة سكانية أقل لأنها ستساعد على الانتهاء بنجاح من سلسلة م...

ينتمي ثيرامبيا المحلية إلى واحدة من أكثر أوامر الحشرات القاعدية ، Zygentoma ، التي تحتفظ بدورة حياة غير اثيرية وغير جناحية. هذه الحالة الفينوغرافية القاعدية وخصائص الأجداد هذه الأنواع هي نموذج جذاب لدراسة الآليات الكامنة في نجاح الحشرات على الأرض، والتي تغطي أكثر من 70٪ من الأنواع الحيوانية الموصوفة1. T. المحلية منذ فترة طويلة تستخدم أساسا لدراسة خصائص الأجداد من علم وظائف الأعضاء الحشرية بسبب ميزات مناسبة كنموذج مختبري، مثل دورة حياة قصيرة نسبيا (2.5-3.0 أشهر من الجنين إلى البالغين الإنجابية؛ الشكل 1أ) وتربية سهلة. في العقود الثلاثة الماضية، تم توسيع استخدامه للتحقيق في خصائص الأجداد من مختلف الصفات مثل خطة الجسم، والتمايز العصبي، والإيقاعات circadian2،3،4.
ويمكن أن يؤدي تطبيق الأدوات الجينية المتقدمة في مجال ت. محلي() إلى زيادة التعجيل بهذه المساهمات في مجال بحثي واسع. تم الإبلاغ عن التدخل الناجح للرنا (RNAi) -بوساطة الجينات في الأجنة والحوريات والبالغين في T. المحلية4,5,6. لا تزال كفاءة RNAi النظامية تعتمد على الأنواع بشكل كبير - على سبيل المثال ، فهي عالية بشكل عام في coleoptera في حين أنها منخفضة في أمر lepidoptera7. ولم يتم بعد تقييم كفاءة ومدة الضربة القاضية لـ RNAi في T. domestica. بالإضافة إلى RNAi، وقد أبلغنا سابقا ناجحة CRISPR / Cas9-بوساطة الجينات بالضربة القاضية في T. المحلية8. وقد تم تطبيق نظام CRISPR / Cas على نطاق واسع لتحرير الجينوم في الحشرات خاصة بالنسبة للجين المستهدف بالضربة القاضية. ويمكن توسيع استخدامه لتطبيقات أخرى مثل مقايسة مراسل الجينات ، وتتبع نسب الخلية ، والتلاعب في النشاط النسخي عن طريق طرق في المنشآت الخارجية بعد إنشاء بروتوكول لتسليم مكونات نظام CRISPR / Cas في النوى9. جنبا إلى جنب مع الجمعية الجينومالمنشورة 10، والاستخدام على نطاق واسع وزيادة تطوير تحرير الجينوم CRISPR / Cas القائم على CAS في T. المحلية من شأنه أن يسهل الدراسات التي تركز على الآليات التطورية وراء النجاح التكيفي المعلقة للحشرات. هنا، نحن وصف بروتوكول مفصل للجنين microinjection والتزاوج الكبار T. المحلية لتوليد سلالة متحولة باستخدام CRISPR / Cas9. وبالنظر إلى هذه الطريقة الجديدة، فإننا نناقش أهمية النظر في البيولوجيا الفريدة للأنواع النموذجية غير التقليدية للتطبيقات الناجحة لهذه التقنيات.

<table><tbody><tr><td>24-well plate</td><td>Corning</td><td>83-3738</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3, 100 &amp;micro;g</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>1081060</td><td></td></tr><tr><td>Anti-static cleaner</td><td>Hozan</td><td>Z-292</td><td>for removing static electricity from a 24-well plate</td></tr><tr><td>Barrier Box 20.7L</td><td>AS ONE</td><td>4-5606-01</td><td>Large container</td></tr><tr><td>FemtoJet 4i</td><td>Eppendorf</td><td>5252000013</td><td>Electronic microinjector</td></tr><tr><td>Femtotip II, injection capillary</td><td>Eppendorf</td><td>5242957000</td><td>Glass injection capillary</td></tr><tr><td>High Pack 2440mL</td><td>AS ONE</td><td>5-068-25</td><td>Middle-sized container</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Panasonic</td><td>MIR-554-PJ</td><td>for 37 &amp;deg;C incubation. No need to humidify inside the incubator.</td></tr><tr><td>KOD Fx Neo</td><td>Toyobo</td><td>KFX-101</td><td>PCR enzyme for genotyping. Optimized for an amplification from crude templates.</td></tr><tr><td>Magnetic stand</td><td>Narishige</td><td>GJ-8</td><td>for holding the micromanipulator</td></tr><tr><td>Microloader</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MM-3</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>SZX12</td><td>for microinjection. More than 35X magnification is sufficient for the microinjection</td></tr><tr><td>MultiNA</td><td>Shimadzu</td><td>MCE-202</td><td>Microchip electrophoresis system</td></tr><tr><td>NiceTac</td><td>Nichiban</td><td>NW-5</td><td>Double-sided tape to place eggs on a glass slide</td></tr><tr><td>Paint brush (horse hair)</td><td>Pentel</td><td>ZBS1-0</td><td></td></tr><tr><td>Plant culture dish</td><td>SPL Life Sciences</td><td>310100</td><td>Mating dish and water supplies for a large and middle-sized containers</td></tr><tr><td>Proteinase K, recombinant, PCR Grade Lyophilizate from Pichia pastoris</td><td>Roche</td><td>3115836001</td><td></td></tr><tr><td>SZX 12 microscope</td><td>Olympus</td><td>SZX 12</td><td>More than 35X magnification is sufficient for the microinjection</td></tr><tr><td>Talcum powder</td><td>Maruishi</td><td>877113</td><td></td></tr><tr><td>Tetra Goldfish Gold Growth</td><td>Spectrum Brands</td><td></td><td>Artificial regular fish food</td></tr></tbody></table>

egg microinjection and efficient mating for genome editing in the firebrat thermobia domestica

وdybrat ثيرامبيا المحلية هي الأنواع غير المنيع ، الجناح الذي هو مناسبة لدراسة آليات النمو للحشرات التي أدت إلى إشعاعها التطوري الناجح على الأرض. إن تطبيق الأدوات الوراثية مثل تحرير الجينوم هو المفتاح لفهم التغيرات الوراثية المسؤولة عن التحولات التطورية في نهج إيفو ديفو. في هذه المقالة، ونحن وصف البروتوكول الحالي لتوليد والحفاظ على سلالات متحولة من T. المحلية. نحن نبلغ عن طريقة الحقن الجاف ، كبديل لطريقة الحقن الرطب المبلغ عنها ، التي تسمح لنا بالحصول على معدلات بقاء عالية بشكل ثابت في الأجنة المحقونة. كما أننا نبلغ عن بيئة مثالية لتزاوج البالغين والحصول على الأجيال اللاحقة بكفاءة عالية. وتؤكد طريقتنا على أهمية أخذ البيولوجيا الفريدة لكل نوع في الاعتبار للتطبيق الناجح لطرق تحرير الجينوم على الكائنات الحية النموذجية غير التقليدية. ونتنبأ بأن بروتوكولات تحرير الجينوم هذه ستساعد في تنفيذ T. domestica كنموذج مختبري وعلى زيادة تسريع تطوير وتطبيق أدوات جينية مفيدة في هذا النوع.

في أيدينا، يمكن حقن حوالي 100 بيضة بشكل جيد مع الشعيرية حقن واحد عندما يكون لديه تلميح كافية (الشكل 3C). حقن مجمع gRNA/Cas9 ribonucleoprotein في الأجنة داخل أول 8 ساعة بعد وضع البيض النتائج في indels في موقع يستهدف GRNA. وهذا يسبب طفرات البجلية في بعض خلايا الجيل المحقون (G0) وبالتالي يتم الحصول عل?...

Watch this Scientific Journal Video about Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica at JoVE.com

Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

نحن نقدم بروتوكول مفصل لتربية, microinjection من البيض و التزاوج كفاءة من firebrat ثيرامبيا المحلية لتوليد والحفاظ على سلالات متحولة بعد تحرير الجينوم.

البيض Microinjection وكفاءة التزاوج لتحرير الجينوم في Firebrat ثيرامبيا المحلية

The firebrat Thermobia domestica is an ametabolous, wingless species that is suitable for studying the developmental mechanisms of insects that led to ...

egg-microinjection-efficient-mating-for-genome-editing-firebrat

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

4.4K Views.  Kyoto University. نحن نقدم بروتوكول مفصل لتربية, microinjection من البيض و التزاوج كفاءة من firebrat ثيرامبيا المحلية لتوليد والحفاظ على سلالات متحولة بعد تحرير الجينوم.

Video: Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. This is due to its reproductive behavior: females damage the external surface of fruits and vegetables when they lay eggs and the hatched larvae feed on their pulp. Wild C. capitata populations are traditionally controlled through insecticide spraying and/or eco-friendly approaches, the most successful being the Sterile Insect Technique (SIT). The SIT relies on mass-rearing, radiation-based sterilization and field release of males that retain their capacity to mate but are not able to generate fertile progeny. The advent and the subsequent rapid development of biotechnological tools, together with the availability of the medfly genome sequence, has greatly boosted our understanding of the biology of this species. This favored the proliferation of new strategies for genome manipulation, which can be applied to population control.
In this context, embryo microinjection plays a dual role in expanding the toolbox for medfly control. The ability to interfere with the function of genes that regulate key biological processes, indeed, expands our understanding of the molecular machinery underlying medfly invasiveness. Furthermore, the ability to achieve germ-line transformation facilitates the production of multiple transgenic strains that can be tested for future field applications in novel SIT settings. Indeed, genetic manipulation can be used to confer desirable traits that can, for example, be used to monitor sterile male performance in the field, or that can result in early life-stage lethality. Here we describe a method to microinject nucleic acids into medfly embryos to achieve these two main goals.

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

تسليم الأحماض النووية من خلال حقن مكروي الأجنة في مكافحة الحشرات الحشرات الزراعية العالمية،<em&gt; آفة Ceratitis الرؤيسية</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

Genetics

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex determination, venom synthesis, and host-symbiont interactions, among others. A major limitation of working with this organism is the lack of effective protocols to perform directed genome modifications. An important part of genome modification is delivery of editing reagents, including CRISPR/Cas9 molecules, into embryos through microinjection. While microinjection is well established in many model organisms, this technique is particularly challenging to perform in N. vitripennis primarily due to its small embryo size, and the fact that embryonic development occurs entirely within a parasitized blowfly pupa. The following procedure overcomes these significant challenges while demonstrating a streamlined, visual procedure for effectively removing wasp embryos from parasitized host pupae, microinjecting them, and carefully transplanting them back into the host for continuation and completion of development. This protocol will strongly enhance the capability of research groups to perform advanced genome modifications in this organism.

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjection of Nasonia vitripennis embryos is an essential method for generating heritable genome modifications. Described here is a detailed procedure for microinjection and transplantation of Nasonia vitripennis embryos, which will greatly facilitate future genome manipulation in this organism.

Microinjection الأجنة وتقنية زرع "التلاعب الجينوم" فيتريبينيس ناسونيا

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has quickly become a commonplace amongst researchers pursuing a wide variety of biological questions. Users most often employ the Cas9 protein derived from Streptococcus pyogenes in a complex with an easily reprogrammed guide RNA (gRNA). These components are introduced into cells, and through a base pairing with a complementary region of the double-stranded DNA (dsDNA) genome, the enzyme cleaves both strands to generate a double-strand break (DSB). Subsequent repair leads to either random insertion or deletion events (indels) or the incorporation of experimenter-provided DNA at the site of the break.
The use of a purified single-guide RNA and Cas9 protein, preassembled to form an RNP and delivered directly to cells, is a potent approach for achieving highly efficient gene editing. RNP editing particularly enhances the rate of gene insertion, an outcome that is often challenging to achieve. Compared to the delivery via a plasmid, the shorter persistence of the Cas9 RNP within the cell leads to fewer off-target events. 
Despite its advantages, many casual users of CRISPR gene editing are less familiar with this technique. To lower the barrier to entry, we outline detailed protocols for implementing the RNP strategy in a range of contexts, highlighting its distinct benefits and diverse applications. We cover editing in two types of primary human cells, T cells and hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs). We also show how Cas9 RNP editing enables the facile genetic manipulation of entire organisms, including the classic model roundworm Caenorhabditis elegans and the more recently introduced model crustacean, Parhyale hawaiensis.

Utilizing a preassembled Cas9 ribonucleoprotein complex (RNP) is a powerful method for precise, efficient genome editing. Here, we highlight its utility across a broad range of cells and organisms, including primary human cells and both classic and emerging model organisms.

تعزيز الجينوم التحرير مع ريبونوكليوبروتين Cas9 في مختلف الخلايا والكائنات الحية

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, Eastern equine encephalitis, lymphatic filariasis, and Saint Louis encephalitis. Notably, avian malaria has played a major role in the extinction of numerous endemic island bird species, while WNV has become an important vector-borne disease in the United States. To gain further insight into C. quinquefasciatus biology and expand their genetic control toolbox, we need to develop more efficient and affordable methods for genome engineering in this species. However, some biological traits unique to Culex mosquitoes, particularly their egg rafts, have made it difficult to perform microinjection procedures required for genome engineering. To address these challenges, we have developed an optimized embryo microinjection protocol that focuses on mitigating the technical obstacles associated with the unique characteristics of Culex mosquitoes. These procedures demonstrate optimized methods for egg collection, egg raft separation and other handling procedures essential for successful microinjection in C. quinquefasciatus. When coupled with the CRISPR/Cas9 genome editing technology, these procedures allow us to achieve site-specific, efficient and heritable germline mutations, which are required to perform advanced genome engineering and develop genetic control technologies in this important, but currently understudied, disease vector.

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

This protocol describes microinjection procedures for Culex quinquefasciatus embryos that are optimized to work with CRISPR/Cas9 gene editing tools. This technique can efficiently generate site-specific, heritable, germline mutations that can be used for building genetic technologies in this understudied disease vector.

تقنيات التلقيح الدقيق الجنيني لتولد موتاسيس محدد الموقع الفعال في Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, ...

Injecting Gryllus bimaculatus Eggs

Altering gene function in a developing organism is central to different kinds of experiments. While tremendously powerful genetic tools have been developed in traditional model systems, it is difficult to manipulate genes or messenger RNA (mRNA) in most other organisms. At the same time, evolutionary and comparative approaches rely on an exploration of gene function in many different species, necessitating the development and adaptation of techniques for manipulating expression outside currently genetically tractable species. This protocol describes a method for injecting reagents into cricket eggs to assay the effects of a given manipulation on embryonic or larval development. Instructions for how to collect and inject eggs with beveled needles are described. This relatively straightforward technique is flexible and potentially adaptable to other insects. One can gather and inject dozens of eggs in a single experiment, and survival rates for buffer-only injections improve with practice and can be as high as 80%. This technique will support several types of experimental approaches including injection of pharmacological agents, in vitro capped mRNA to express genes of interest, double-stranded RNA (dsRNA) to achieve RNA interference, use of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) in concert with CRISPR-associated protein 9 (Cas9) reagents for genomic modification, and transposable elements to generate transient or stable transgenic lines.

Injecting Gryllus bimaculatus Eggs

Here we present a protocol to inject cricket eggs, a technique which serves as a foundational method in many experiments in the cricket, including, but not limited to, RNA interference and genomic manipulation.

حقن Gryllus بيماكولاتوس البيض

Altering gene function in a developing organism is central to different kinds of experiments. While tremendously powerful genetic tools have been ...

Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera (H&#252;bner)

The cotton bollworm, Helicoverpa armigera, is one of the most destructive pests in the world. A combination of molecular genetics, physiology, functional genomics, and behavioral studies has made H. armigera a model species in Lepidoptera Noctuidae. To study the in vivo functions of and interactions between different genes, clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/ associated protein 9 (Cas9) genome editing technology is a convenient and effective method used for performing functional genomic studies. In this study, we provide a step-by-step systematic method to complete gene knockout in H. armigera using the CRISPR/Cas9 system. The design and synthesis of guide RNA (gRNA) are described in detail. Then, the subsequent steps consisting of gene-specific primer design for guide RNA (gRNA) creation, embryo collection, microinjection, insect rearing, and mutant detection are summarized. Finally, troubleshooting advice and notes are provided to improve the efficiency of gene editing. Our method will serve as a reference for the application of CRISPR/Cas9 genome editing in H. armigera as well as other Lepidopteran moths.

Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera H&#252;bner

Presented here is a protocol of Helicoverpa armigera (H&#252;bner) embryo microinjection and knockout mutant identification created by CRISPR/Cas9 genome editing. Mutant insects enable further research of gene function and interaction among different genes in vivo.

الحقن المجهري للأجنة وتحديد المتحورات بالضربة القاضية ل CRISPR / Cas9 Genome edited Helicoverpa Armigera (Hübner)

The cotton bollworm, Helicoverpa armigera, is one of the most destructive pests in the world. A combination of molecular genetics, physiology, functional ...

Behavior

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although RNA interference (RNAi) has proved to be a powerful tool for studying WCR biology, it has its limitations. Specifically, RNAi itself is transient (i.e. does not result in long-term Mendelian inheritance of the associated phenotype), and it requires knowing the DNA sequence of the target gene. The latter can be limiting if the phenotype of interest is controlled by poorly conserved, or even novel genes, because identifying useful targets would be challenging, if not impossible. Therefore, the number of tools in WCR&#39;s genomic toolbox should be expanded by the development of methods that could be used to create stable mutant strains and enable sequence-independent surveys of the WCR genome. Herein, we detail the methods used to collect and microinject precellular WCR embryos with nucleic acids. While the protocols described herein are aimed at the creation of transgenic WCR, CRISPR/Cas9-genome editing could also be performed using the same protocols, with the only difference being the composition of the solution injected into the embryos.

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Here we present protocols for collecting and microinjecting precellular western corn rootworm embryos for the purpose of performing functional-genomic assays such as germline transformation and CRISPR/Cas9-genome editing.

Microinjection "روتوورم الذرة الغربية"، ظهرت فيرجيفيرا فيرجيفيرا، والأجنة لتحويل الخط، أو تحرير الجينوم كريسبر/Cas9

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

Bioengineering

Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these independently derived phenotypes, which share a common genetic architecture. This is perhaps best exemplified by the numerous convergent features of gymnotiforms and mormyrids, two species-rich teleost clades that produce and detect weak electric fields and are called weakly electric fish. In the 50 years since the discovery that weakly electric fish use electricity to sense their surroundings and communicate, a growing community of scientists has gained tremendous insights into evolution of development, systems and circuits neuroscience, cellular physiology, ecology, evolutionary biology, and behavior. More recently, there has been a proliferation of genomic resources for electric fish. Use of these resources has already facilitated important insights with regards to the connection between genotype and phenotype in these species. A major obstacle to integrating genomics data with phenotypic data of weakly electric fish is a present lack of functional genomics tools. We report here a full protocol for performing CRISPR/Cas9 mutagenesis that utilizes endogenous DNA repair mechanisms in weakly electric fish. We demonstrate that this protocol is equally effective in both the mormyrid species Brienomyrus brachyistius and the gymnotiform Brachyhypopomus gauderio by using CRISPR/Cas9 to target indels and point mutations in the first exon of the sodium channel gene scn4aa. Using this protocol, embryos from both species were obtained and genotyped to confirm that the predicted mutations in the first exon of the sodium channel scn4aa were present. The knock-out success phenotype was confirmed with recordings showing reduced electric organ discharge amplitudes when compared to uninjected size-matched controls.

Here, a protocol is presented to produce and rear CRISPR/Cas9 genome knockout electric fish. Outlined in detail are the required molecular biology, breeding, and husbandry requirements for both a gymnotiform and a mormyrid, and injection techniques to produce Cas9-induced indel F0 larvae.

إسكات شراره: CRISPR/كاس 9 الجينوم التحرير في الأسماك الكهربائية ضعيف

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these ...

Biology

Hyperactive piggyBac Transposase-mediated Germline Transformation in the Fall Armyworm, Spodoptera frugiperda

Stable insertion of genetic cargo into insect genomes using transposable elements is a powerful tool for functional genomic studies and developing genetic pest management strategies. The most used transposable element in insect transformation is piggyBac, and piggyBac-based germline transformation has been successfully conducted in model insects. However, it is still challenging to employ this technology in non-model insects that include agricultural pests. This paper reports on germline transformation of a global agricultural pest, the fall armyworm (FAW), Spodoptera frugiperda, using the hyperactive piggyBac transposase (hyPBase).
In this work, the hyPBase mRNA was produced and used in place of helper plasmid in embryo microinjections. This change led to the successful generation of transgenic FAW. Furthermore, the methods of screening transgenic animals, PCR-based rapid detection of transgene insertion, and thermal asymmetric interlaced PCR (TAIL-PCR)-based determination of the integration site, are also described. Thus, this paper presents a protocol to produce transgenic FAW, which will facilitate piggyBac-based transgenesis in FAW and other lepidopteran insects.

Hyperactive piggyBac Transposase-mediated Germline Transformation in the Fall Armyworm, Spodoptera frugiperda

Successful germline transformation in the fall armyworm, Spodoptera frugiperda, was achieved using mRNA of hyperactive piggyBac transposase.

مفرط piggyBac Transposase بوساطة التحول Germline في دودة الجيش الخريف، Spodoptera frugiperda

Stable insertion of genetic cargo into insect genomes using transposable elements is a powerful tool for functional genomic studies and developing genetic ...

Protocols for CRISPR/Cas9 Mutagenesis of the Oriental Fruit Fly Bactrocera dorsalis

The Oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis, is a highly invasive and adaptive pest species that causes damage to citrus and over 150 other fruit crops worldwide. Since adult fruit flies have great flight capacity and females lay their eggs under the skins of fruit, insecticides requiring direct contact with the pest usually perform poorly in the field. With the development of molecular biological tools and high-throughput sequencing technology, many scientists are attempting to develop environmentally friendly pest management strategies. These include RNAi or gene editing-based pesticides that downregulate or silence genes (molecular targets), such as olfactory genes involved in searching behavior, in various insect pests. To adapt these strategies for Oriental fruit fly control, effective methods for functional gene research are needed. Genes with critical functions in the survival and reproduction of B. dorsalis serve as good molecular targets for gene knockdown and/or silencing. The CRISPR/Cas9 system is a reliable technique used for gene editing, especially in insects. This paper presents a systematic method for CRISPR/Cas9 mutagenesis of B. dorsalis, including the design and synthesis of guide RNAs, collecting embryos, embryo injection, insect rearing, and mutant screening. These protocols will serve as a useful guide for generating mutant flies for researchers interested in functional gene studies in B. dorsalis.

Protocols for CRISPR/Cas9 Mutagenesis of the Oriental Fruit Fly Bactrocera dorsalis

This paper presents the step-by-step protocols for CRISPR/Cas9 mutagenesis of the Oriental fruit fly Bactrocera dorsalis. Detailed steps provided by this standardized protocol will serve as a useful guide for generating mutant flies for functional gene studies in B. dorsalis.

بروتوكولات كريسبر / كاس 9 طفرات ذبابة الفاكهة الشرقية باكتروسيرا الظهرية

The Oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis, is a highly invasive and adaptive pest species that causes damage to citrus and over 150 other fruit crops ...