To y TD fueron apoyados por los números de subvención JSPS KAKENHI 19H02970 y 20H02999, respectivamente.

1. Mantenimiento de colonias de laboratorio
<ol><li>Para el mantenimiento de poblaciones de wildtype y mutantes, utilice un recipiente de plástico grande (460 mm x 360 mm x 170 mm) con alimentos artificiales regulares para peces, agua en vasos de plástico con un orificio de ventilación en la parte superior, un papel doblado para ocultar los insectos y algodón en capas para poner huevos(Figura 2A). Mantenga todos los cultivos de T. domestica dentro de incubadoras de 37 °C y establezca la humedad relativa (RH) dentro de cada recipiente en 60%-80%. NOTA: Debido a que T. domestica absorbe vapor de agua de la atmósfera11,no se necesita un suministro directo de agua. El RH adecuado se mantiene debido a la presencia de vapor de agua de vasos de plástico que contienen un orificio de ventilación en la parte superior o de tazas sin tapa dentro de cada recipiente. No hay necesidad de humidificar dentro de toda una incubadora que contiene cultivos. La duración aproximada de cada etapa de desarrollo bajo la condición descrita en este protocolo se muestra en la Figura 1. La velocidad de desarrollo podría ajustarse cambiando la temperatura y/o rh12.</li>
	<li>Agregue los alimentos periódicamente. Agregue agua antes de que se seque.</li>
	<li>Transfiera las poblaciones a un nuevo recipiente limpio al menos cada 3 meses, dado que los adultos dejan de poner huevos en un ambiente sucio y/o población densa (ver Discusión).</li>
</ol>2. Recolección de huevos y microinjección
<ol><li>Diseñar un ARN guía (gRNA)<ol>
<li>Diseñe una secuencia de gRNA para cada objetivo necesario y BLAST las secuencias de gRNA en el ensamblaje del genoma para comprobar posibles sitios de reconocimiento fuera de destino.</li>
		<li>Sintetizar y purificar los gRNAs de acuerdo con las instrucciones del fabricante8. NOTA: Como ejemplo, en el caso de dirigirse al gen blanco transportador de casete de unión a ATP, se diseñó una secuencia objetivo de 20 bp y se ordenaron dos oligonucleótidos de ADN sintetizados 5'-TAATACACTCACTATAGTAAGTGTTGGTGGGAC-3' y 5'-TTCTAGCTCTAAAACATCCCCCAACACTTA-3'. La plantilla de ADN se preparó recocido estos dos oligonucleótidos seguidos de amplificación de PCR y el gRNA se transcribe in vitro de la plantilla con una polimerasa de ARN T7.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparan colonias de recolección de huevo<ol>
<li>Transfiera alrededor de 20 adultos machos y 20 hembras a un recipiente de tamaño mediano (200 mm x 150 mm x 90 mm) con alimentos, suministro de agua, un papel doblado y un pequeño trozo de algodón en capas para la puesta de huevos(Figura 2B).</li>
		<li>Establecer varias colonias para obtener un gran número de embriones escenificados en un corto período de tiempo para ser utilizados para la edición del genoma. NOTA: Se espera que se recojan entre 20 y 40 huevos de una colonia después de 8 h a 37 °C. Por lo general, los adultos transferidos tardan unos días en empezar a poner huevos, posiblemente debido a la adaptación a un nuevo entorno.</li>
	</ol></li>
	<li>El día de la inyección, reemplace el algodón dentro de los recipientes por otros nuevos.</li>
	<li>Coloque una cinta de doble cara de 76 mm x 5 mm en una tobogán de vidrio normal de 76 mm x 26 mm.</li>
	<li>Ocho horas más tarde, recoge los huevos del algodón en capas separando las capas usando fórceps.</li>
	<li>Alinee los huevos en la cinta de doble cara con un pincel húmedo y mantenga una distancia de 2 mm entre los huevos. Todos los huevos deben estar orientados para que el eje longitudinal de un huevo se enfrente al lado de la inyección(Figura 3A). Presione suavemente los huevos con un pincel para sujetar firmemente durante la inyección. NOTA: En este protocolo, el hongo crece rápidamente en huevos inyectados dañados en condiciones húmedas y cálidas. Es importante mantener la distancia entre los huevos para evitar la contaminación cruzada y la expansión del hongo.</li>
	<li>Mezcle la proteína gRNA y Cas9 a una concentración final de 100 ng/μL y 500 ng/μL, respectivamente. Utilice agua destilada para diluirla. Incubar la mezcla durante 10 minutos a temperatura ambiente para promover la formación compleja ribonucleoprotein y luego mantener la mezcla en hielo. NOTA: Rojo neutro a una concentración final del 1% podría añadirse a la solución de inyección para controlar la cantidad inyectada.</li>
	<li>Cargue 2 μL de la solución gRNA/Cas9 en un capilar de inyección de vidrio con un microcargador. Asegúrese de que no haya burbujas de aire en la solución antes de la inyección. Si es necesario, toque la aguja para extraer las burbujas. NOTA: En este experimento, se utiliza una aguja prefabricada para obtener una punta de aguja fina (Figura 3B). En su lugar, se podría utilizar una aguja casera con una forma similar.</li>
	<li>Fijar el capilar de inyección de vidrio, previamente cargado con la solución gRNA/Cas9, a un soporte equipado con un manipulador y conectar el soporte a un microinyector electrónico.</li>
	<li>Optimice la forma de la punta de la aguja rompiéndolo ligeramente con fórceps para evitar obstrucciones y obteniendo una mejor durabilidad a lo largo de una serie de inyecciones (se muestra un ejemplo de una aguja adecuada en la Figura 3C). NOTA: Se recomienda cambiar una aguja cuando está obstruida. Es posible seguir inyectando con la misma aguja si se rompe de nuevo con fórceps, pero una punta más ancha conduce a más daño del huevo y reduce su tasa de supervivencia. Como los huevos T. domestica son blandos y frágiles, mantener una punta fina de aguja es clave para tener una alta tasa de supervivencia después de la inyección.</li>
	<li>Inserte la aguja en el punto medio del eje longitudinal de un huevo e inyecte una ligera cantidad de la solución (consulte la Figura 3D-H como referencia sobre la cantidad de inyección). Ajuste la configuración del microinyector electrónico durante la inyección, dependiendo de la forma de la punta de la aguja. NOTA: Se recomienda aplicar una presión constante durante la inyección, de lo contrario el contenido pegajoso del huevo puede fluir fácilmente en la aguja de vidrio y puede obstruirla. La solución puede ser inyectar un pulso de presión corto o con una presión constante, dependiendo de la cantidad de líquido inyectado. Tenga en cuenta que cuando una punta de aguja tiene una abertura amplia, se inyecta demasiada solución en un óvulo, lo que causa letalidad(Figura 3F-H). En ese caso, mantenga un flujo de líquido constante por presión constante, luego inserte la aguja en un huevo y extraiga inmediatamente. Si causa demasiado desbordamiento o el huevo estalla, cambie la aguja.</li>
	<li>Mantenga los huevos inyectados en un recipiente con el tamaño adecuado para el número de huevos inyectados (<20 huevos: plato pequeño; >20 huevos: recipiente de tamaño mediano) con 60%-80% RH y 37 °C.</li>
</ol>3. Apareamiento
<ol><li>Revise los huevos inyectados periódicamente y deseche los huevos dañados con fórceps para evitar el crecimiento fúngico(Figura 3I,J). En caso de que haya demasiado hongo creciendo en un huevo, limpie la superficie del huevo con un 70% de EtOH.</li>
	<li>Antes de eclosionar (aproximadamente 10 días a 37 °C después de la puesta de huevos), sumerja el vaso con los huevos inyectados en polvo de talco para cubrir la superficie de la cinta de doble cara. Esto evitará el apilamiento de ninfas eclosionadas. Transfiera los toboganes de vidrio recubiertos de polvo a un recipiente de tamaño mediano con alimentos, agua y un papel doblado para ocultar los insectos.</li>
	<li>Retire las diapositivas de vidrio después de que las ninfas hayan eclosionado. Suministran alimentos periódicamente hasta que lleguen a la edad adulta. NOTA: Se tarda aproximadamente 2.0–2.5 meses para que las personas lleguen a la edad adulta después de eclosionar(Figura 1A). La etapa adulta se juzga sobre la base de un ovipositor bien desarrollado en las hembras(Figura 1B).</li>
	<li>Para aparear a los individuos, transfiera tantos como sea necesario a adultos hembras de wildtype de una colonia de laboratorio al contenedor mediano e incubarlos durante al menos 14 días a 37 °C para asegurarse de que son vírgenes. NOTA: No es necesario recoger hembras vírgenes de una colonia de laboratorio porque las T. domestica adultas tienen un ciclo repetido de fundido y apareamiento llamado "ciclo reproductivo y ardiente", durante el cual las hembras tiran espermatozoides con cada muda y se aparean de nuevo en el siguiente ciclo de fertilización13.</li>
	<li>Transfiera un adulto G0 macho o hembra que se desarrolló de un huevo inyectado y un(los) adulto(s) de wildtype a un pequeño plato de plástico (Ø 100 mm x 40 mm) con alimentos, un papel doblado y un pequeño trozo de algodón para poner huevos G1(Figura 2C';plato de apareamiento). Mantenga los platos de apareamiento en un recipiente más grande con 60%-80% RH(Figura 2C). NOTA: Múltiples adultos de wildtype pueden ser incluidos en un plato para aumentar la probabilidad de apareamiento exitoso, aunque se han logrado altas tasas de éxito con emparejamiento uno a uno.</li>
</ol>4. Genotipado
<ol><li>Diseñe pares de imprimación PCR para cada gRNA para amplificar un producto de 100-200 bp que incluye el sitio dirigido por el gRNA. BLAST cada primera secuencia contra el ensamblaje del genoma para comprobar su especificidad (se muestra un ejemplo para la focalización del gen blanco en la Figura 4A).</li>
	<li>Compruebe la transformación germinina de los adultos G0.<ol>
<li>Cinco días después de que se ponen los huevos, recoger huevos G1 individuales de cada par adulto G0 en tubos de 0,2 ml (un huevo por tubo; almacenar muestras recogidas a -20 °C para un almacenamiento a largo plazo). Separe las capas de algodón para recoger los huevos. NOTA: Se recomienda genotipo de al menos 12 ninfas G1 de cada par de acoplamiento para evaluar el éxito de la transmisión de la línea germinográfica (ver Resultados representativos).</li>
		<li>Añadir 15 μL de una solución Proteinasa K de 0,25 mg/ml (disuelta en tampón Tris-EDTA) a cada tubo, homogeneizar brevemente muestras con palillos de dientes e incubar a 55 °C durante 3 a 16 h.</li>
		<li>Inactive la Proteinasa K colocando las muestras a 95 °C durante 10 min.</li>
		<li>Añadir 90 μL de agua destilada a cada tubo y mezclar bien. Utilice 2 μL de sobrenadante en una mezcla de reacción PCR de 10 μL que contenga las imprimaciones diseñadas en el paso 4.1. NOTA: Se recomienda el uso de una polimerasa de ADN optimizada para plantillas crudas para alcanzar suficiente amplificación de PCR.</li>
		<li>Para analizar los productos PCR, realice un ensayo de movilidad heteroduplex (HMA) con un sistema de electroforesis de microchip(Figura 3B;ver Ohde et al., 2018)8. NOTA: Las mutaciones podrían evaluarse con dos métodos alternativos: (1) HMA con polímeros de gel estándar, como 8% poliacrilamida14; (2) digestión de productos DEP con endonuclease T7 seguido de electroforesis de gel de agarose15.</li>
		<li>Mantenga sólo las ninfas G1 resultantes de los adultos G0 que contienen mutaciones en su línea germino y deseche las otras.</li>
	</ol></li>
	<li>Genotipado individual de ninfas/adultos G1<ol>
<li>Aísle las ninfas G1 en placas de 24 pozos con un aspirador o un pincel. Coloque las placas de 24 pozos en un recipiente más grande (por ejemplo, el recipiente mediano utilizado en este protocolo) con suministro de agua como se describió anteriormente para mantener un RH del 60%-80%(Figura 1D). Mantener el suministro de alimentos artificiales regulares para el pescado(Figura 1D'). NOTA: Aunque este paso se puede realizar en cualquier punto de las etapas de ninfas y adultos, se recomienda realizarlo después de llegar a la edad adulta y justo antes del emparejamiento (>2.5 meses después de la inyección; Figura 1B) porque es más fácil mantener los ignífugos en un recipiente grande. Se requiere una cría individual para rastrear el genotipo de cada ninfa G1 en los siguientes pasos. Las ninfas G1 del mismo adulto G0 pueden tener mutaciones diferentes.</li>
		<li>Pellizque y tire de cerci y el filamento caudal de una ninfa/adulto usando fórceps y recogerlos en un tubo de 0,2 ml que contenga 50 μL EtOH (almacene las muestras recogidas a -20 °C para un almacenamiento a largo plazo). NOTA: Las muestras de tejido se recogen en etoh porque evita la pérdida de estas pequeñas muestras debido a la electricidad estática. Si uno necesita detener el movimiento de los insectos, anestesia ninfa/adulto en hielo al tomar muestras de tejido. Debido a que T. domestica no puede sobrevivir después del enfriamiento a largo plazo en el hielo, no los anestesia durante más de un minuto e inmediatamente los mueva de vuelta a temperatura ambiente. La ablación del cerci y el filamento caudal no causa un aumento de la mortalidad.</li>
		<li>Coloque tubos de muestra con las tapas abiertas en un bloque térmico durante 15 minutos a 70 °C para evaporar el EtOH.</li>
		<li>Repita los pasos 4.2.2–4.2.5 para genotipado.</li>
		<li>Envíe los productos PCR en los que se observa un patrón de banda mutante a un servicio de secuenciación Sanger estándar.</li>
		<li>Mantenga las ninfas/adultos G1 con las mutaciones deseadas y deseche las demás (consulte la Figura 4C para obtener un resultado representativo de secuenciación).</li>
	</ol></li>
	<li>Cruza a los adultos que contienen las mutaciones deseadas en un plato de apareamiento y obtiene las próximas generaciones para establecer una cepa mutante homocigólica.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Peterson, M. D., Rogers, B. T., Popadi&#263;, A., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+expression+pattern+of+labial,+posterior+homeotic+complex+genes+and+the+teashirt+homologue+in+an+apterygote+insect.">The embryonic expression pattern of labial, posterior homeotic complex genes and the teashirt homologue in an apterygote insect.</a> Development Genes and Evolution. 209, 77-90 (1999).</li><li>Farris, S. 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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Insect Hormones. , (1994).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+detection,+quantification+and+enrichment+of+subtle+allelic+alterations.">Efficient detection, quantification and enrichment of subtle allelic alterations.</a> DNA Research. 19, 423-433 (2012).</li><li>Mashal, R. D., Koontz, J., Sklar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+mutations+by+cleavage+of+DNA+heteroduplexes+with+bacteriophage+resolvases.">Detection of mutations by cleavage of DNA heteroduplexes with bacteriophage resolvases.</a> Nature Genetics. 9, 177-183 (1995).</li><li>Adams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+notes+upon+the+firebrat,+Thermobia+domestica+Packard.">Biological notes upon the firebrat, Thermobia domestica Packard.</a> Journal of the New York Entomological Society. 41, 557-562 (1933).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Para la generación exitosa del mutante T. domestica deseado con CRISPR/Cas9, primero es importante recoger un número suficiente de embriones escenificados para la inyección. Para una recolección constante de un número suficiente de huevos T. domestica, la clave es seleccionar un tamaño adecuado del recipiente para tener una menor densidad de población porque ayudaría a completar con éxito una serie de comportamientos complejos de apareamiento, que se repite después de cada muda adulta<sup clas...

Thermobia domestica pertenece a una de las órdenes de insectos más basales, Zygentoma, que conserva un ciclo de vida ancestral ametaboloso y sin alas. Tal posición filogenética basal y características ancestrales establecen a esta especie como un modelo atractivo para estudiar los mecanismos subyacentes al éxito de los insectos en la Tierra, que cubren más del 70% de las especies animales descritas1. T. domestica se ha utilizado durante mucho tiempo principalmente para estudiar las características ancestrales de la fisiología de insectos debido a sus características adecuadas como modelo de laboratorio, como un ciclo de vida relativamente corto (2,5–3,0 meses de embrión a adulto reproductor; Figura 1A) y una cría fácil. En las últimas tres décadas, su uso se ha ampliado para investigar características ancestrales de diversos rasgos como el plan corporal, la diferenciación neuronal y los ritmos circadianos2,3,4.
La aplicación de herramientas genéticas avanzadas en T. domestica podría acelerar aún más esas contribuciones en un amplio área de investigación. Se ha notificado una interferencia exitosa del ARN (ARN) en embriones, ninfas y adultos en T. domestica4,5,6. La eficiencia del RNAi sistémico sigue siendo altamente dependiente de las especies, por ejemplo, generalmente es alta en coleoptera, mientras que es baja en el ordenlepidópteros 7. La eficiencia y duración del derribo de la RNAi en T. domestica aún no ha sido evaluada. Además de RNAi, hemos informado previamente de un exitoso knockout genético mediado por CRISPR/Cas9 en T. domestica8. El sistema CRISPR/Cas se ha aplicado ampliamente para la edición del genoma en insectos, particularmente para el knockout genético específico. Su uso podría ampliarse para otras aplicaciones como el ensayo de reporteros genéticos, el seguimiento del linaje celular y la manipulación de la actividad transcripcional mediante el derribo de construcciones exógenas después del establecimiento de un protocolo para la entrega de componentes del sistema CRISPR/Cas en núcleos9. Combinado con el ensamblaje del genoma publicado10,el uso amplio y el desarrollo posterior de la edición del genoma basado en CRISPR/Cas en T. domestica facilitarían estudios centrados en los mecanismos evolutivos detrás del excepcional éxito adaptativo de los insectos. Aquí, describimos un protocolo detallado para la microinyección embrionaria y para aparear T. domestica adulto para generar una cepa mutante usando CRISPR/Cas9. Teniendo en cuenta este novedoso método, discutimos la importancia de considerar la biología única de las especies modelo no tradicionales para aplicaciones exitosas de estas técnicas.

<table><tbody><tr><td>24-well plate</td><td>Corning</td><td>83-3738</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3, 100 &amp;micro;g</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>1081060</td><td></td></tr><tr><td>Anti-static cleaner</td><td>Hozan</td><td>Z-292</td><td>for removing static electricity from a 24-well plate</td></tr><tr><td>Barrier Box 20.7L</td><td>AS ONE</td><td>4-5606-01</td><td>Large container</td></tr><tr><td>FemtoJet 4i</td><td>Eppendorf</td><td>5252000013</td><td>Electronic microinjector</td></tr><tr><td>Femtotip II, injection capillary</td><td>Eppendorf</td><td>5242957000</td><td>Glass injection capillary</td></tr><tr><td>High Pack 2440mL</td><td>AS ONE</td><td>5-068-25</td><td>Middle-sized container</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Panasonic</td><td>MIR-554-PJ</td><td>for 37 &amp;deg;C incubation. No need to humidify inside the incubator.</td></tr><tr><td>KOD Fx Neo</td><td>Toyobo</td><td>KFX-101</td><td>PCR enzyme for genotyping. Optimized for an amplification from crude templates.</td></tr><tr><td>Magnetic stand</td><td>Narishige</td><td>GJ-8</td><td>for holding the micromanipulator</td></tr><tr><td>Microloader</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MM-3</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>SZX12</td><td>for microinjection. More than 35X magnification is sufficient for the microinjection</td></tr><tr><td>MultiNA</td><td>Shimadzu</td><td>MCE-202</td><td>Microchip electrophoresis system</td></tr><tr><td>NiceTac</td><td>Nichiban</td><td>NW-5</td><td>Double-sided tape to place eggs on a glass slide</td></tr><tr><td>Paint brush (horse hair)</td><td>Pentel</td><td>ZBS1-0</td><td></td></tr><tr><td>Plant culture dish</td><td>SPL Life Sciences</td><td>310100</td><td>Mating dish and water supplies for a large and middle-sized containers</td></tr><tr><td>Proteinase K, recombinant, PCR Grade Lyophilizate from Pichia pastoris</td><td>Roche</td><td>3115836001</td><td></td></tr><tr><td>SZX 12 microscope</td><td>Olympus</td><td>SZX 12</td><td>More than 35X magnification is sufficient for the microinjection</td></tr><tr><td>Talcum powder</td><td>Maruishi</td><td>877113</td><td></td></tr><tr><td>Tetra Goldfish Gold Growth</td><td>Spectrum Brands</td><td></td><td>Artificial regular fish food</td></tr></tbody></table>

egg microinjection and efficient mating for genome editing in the firebrat thermobia domestica

El firebrat Thermobia domestica es una especie ametabolosa y sin alas que es adecuada para estudiar los mecanismos de desarrollo de los insectos que condujeron a su exitosa radiación evolutiva en la Tierra. La aplicación de herramientas genéticas como la edición del genoma es la clave para entender los cambios genéticos que son responsables de las transiciones evolutivas en un enfoque Evo-Devo. En este artículo, describimos nuestro protocolo actual para generar y mantener cepas mutantes de T. domestica. Informamos de un método de inyección en seco, como alternativa al método de inyección húmeda notificado, que nos permite obtener tasas de supervivencia establemente altas en embriones inyectados. También informamos de un entorno optimizado para acoplar adultos y obtener generaciones posteriores con alta eficiencia. Nuestro método subraya la importancia de tener en cuenta la biología única de cada especie para la aplicación exitosa de métodos de edición del genoma a organismos modelo no tradicionales. Predicemos que estos protocolos de edición del genoma ayudarán a implementar T. domestica como modelo de laboratorio y a acelerar aún más el desarrollo y la aplicación de herramientas genéticas útiles en esta especie.

En nuestras manos, alrededor de 100 huevos se pueden inyectar bien con un solo capilar de inyección cuando tiene la punta adecuada(Figura 3C). Inyección de gRNA/Cas9 complejo ribonucleoprotein en embriones dentro de las primeras 8 h después de la puesta de óvulos resulta en indels en el sitio objetivo de gRNA. Esto causa mutaciones biallelicas en algunas células de la generación inyectada (G0) y por lo tanto los fenotipos de mosaico mutantes generalmente se obtienen en G0. Por ejemplo,...

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Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

Proporcionamos un protocolo detallado para la cría, microinjección de huevos y para el apareamiento eficiente del firebrat Thermobia domestica para generar y mantener cepas mutantes después de la edición del genoma.

Microinyección de óvulos y apareamiento eficiente para la edición del genoma en la thermobia doméstica de firebrat

The firebrat Thermobia domestica is an ametabolous, wingless species that is suitable for studying the developmental mechanisms of insects that led to ...

egg-microinjection-efficient-mating-for-genome-editing-firebrat

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

4.3K vistas.  Kyoto University. Proporcionamos un protocolo detallado para la cría, microinjección de huevos y para el apareamiento eficiente del firebrat Thermobia domestica para generar y mantener cepas mutantes después de la edición del genoma.

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Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. This is due to its reproductive behavior: females damage the external surface of fruits and vegetables when they lay eggs and the hatched larvae feed on their pulp. Wild C. capitata populations are traditionally controlled through insecticide spraying and/or eco-friendly approaches, the most successful being the Sterile Insect Technique (SIT). The SIT relies on mass-rearing, radiation-based sterilization and field release of males that retain their capacity to mate but are not able to generate fertile progeny. The advent and the subsequent rapid development of biotechnological tools, together with the availability of the medfly genome sequence, has greatly boosted our understanding of the biology of this species. This favored the proliferation of new strategies for genome manipulation, which can be applied to population control.
In this context, embryo microinjection plays a dual role in expanding the toolbox for medfly control. The ability to interfere with the function of genes that regulate key biological processes, indeed, expands our understanding of the molecular machinery underlying medfly invasiveness. Furthermore, the ability to achieve germ-line transformation facilitates the production of multiple transgenic strains that can be tested for future field applications in novel SIT settings. Indeed, genetic manipulation can be used to confer desirable traits that can, for example, be used to monitor sterile male performance in the field, or that can result in early life-stage lethality. Here we describe a method to microinject nucleic acids into medfly embryos to achieve these two main goals.

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

Entrega de ácidos nucleicos mediante microinyección de embriones en el Mundial de la Agricultura de plagas de insectos,<em&gt; Ceratitis capitata</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

Investigación

Genética

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex determination, venom synthesis, and host-symbiont interactions, among others. A major limitation of working with this organism is the lack of effective protocols to perform directed genome modifications. An important part of genome modification is delivery of editing reagents, including CRISPR/Cas9 molecules, into embryos through microinjection. While microinjection is well established in many model organisms, this technique is particularly challenging to perform in N. vitripennis primarily due to its small embryo size, and the fact that embryonic development occurs entirely within a parasitized blowfly pupa. The following procedure overcomes these significant challenges while demonstrating a streamlined, visual procedure for effectively removing wasp embryos from parasitized host pupae, microinjecting them, and carefully transplanting them back into the host for continuation and completion of development. This protocol will strongly enhance the capability of research groups to perform advanced genome modifications in this organism.

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjection of Nasonia vitripennis embryos is an essential method for generating heritable genome modifications. Described here is a detailed procedure for microinjection and transplantation of Nasonia vitripennis embryos, which will greatly facilitate future genome manipulation in this organism.

Microinyección de embriones y la técnica de trasplante para la manipulación del genoma de Nasonia vitripennis

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has quickly become a commonplace amongst researchers pursuing a wide variety of biological questions. Users most often employ the Cas9 protein derived from Streptococcus pyogenes in a complex with an easily reprogrammed guide RNA (gRNA). These components are introduced into cells, and through a base pairing with a complementary region of the double-stranded DNA (dsDNA) genome, the enzyme cleaves both strands to generate a double-strand break (DSB). Subsequent repair leads to either random insertion or deletion events (indels) or the incorporation of experimenter-provided DNA at the site of the break.
The use of a purified single-guide RNA and Cas9 protein, preassembled to form an RNP and delivered directly to cells, is a potent approach for achieving highly efficient gene editing. RNP editing particularly enhances the rate of gene insertion, an outcome that is often challenging to achieve. Compared to the delivery via a plasmid, the shorter persistence of the Cas9 RNP within the cell leads to fewer off-target events. 
Despite its advantages, many casual users of CRISPR gene editing are less familiar with this technique. To lower the barrier to entry, we outline detailed protocols for implementing the RNP strategy in a range of contexts, highlighting its distinct benefits and diverse applications. We cover editing in two types of primary human cells, T cells and hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs). We also show how Cas9 RNP editing enables the facile genetic manipulation of entire organisms, including the classic model roundworm Caenorhabditis elegans and the more recently introduced model crustacean, Parhyale hawaiensis.

Utilizing a preassembled Cas9 ribonucleoprotein complex (RNP) is a powerful method for precise, efficient genome editing. Here, we highlight its utility across a broad range of cells and organisms, including primary human cells and both classic and emerging model organisms.

Mayor genoma edición con Cas9 ribonucleoproteína en diversas células y organismos

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, Eastern equine encephalitis, lymphatic filariasis, and Saint Louis encephalitis. Notably, avian malaria has played a major role in the extinction of numerous endemic island bird species, while WNV has become an important vector-borne disease in the United States. To gain further insight into C. quinquefasciatus biology and expand their genetic control toolbox, we need to develop more efficient and affordable methods for genome engineering in this species. However, some biological traits unique to Culex mosquitoes, particularly their egg rafts, have made it difficult to perform microinjection procedures required for genome engineering. To address these challenges, we have developed an optimized embryo microinjection protocol that focuses on mitigating the technical obstacles associated with the unique characteristics of Culex mosquitoes. These procedures demonstrate optimized methods for egg collection, egg raft separation and other handling procedures essential for successful microinjection in C. quinquefasciatus. When coupled with the CRISPR/Cas9 genome editing technology, these procedures allow us to achieve site-specific, efficient and heritable germline mutations, which are required to perform advanced genome engineering and develop genetic control technologies in this important, but currently understudied, disease vector.

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

This protocol describes microinjection procedures for Culex quinquefasciatus embryos that are optimized to work with CRISPR/Cas9 gene editing tools. This technique can efficiently generate site-specific, heritable, germline mutations that can be used for building genetic technologies in this understudied disease vector.

Técnicas de microinyección embrionaria para una mutagénesis eficiente site-specific en Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, ...

Injecting Gryllus bimaculatus Eggs

Altering gene function in a developing organism is central to different kinds of experiments. While tremendously powerful genetic tools have been developed in traditional model systems, it is difficult to manipulate genes or messenger RNA (mRNA) in most other organisms. At the same time, evolutionary and comparative approaches rely on an exploration of gene function in many different species, necessitating the development and adaptation of techniques for manipulating expression outside currently genetically tractable species. This protocol describes a method for injecting reagents into cricket eggs to assay the effects of a given manipulation on embryonic or larval development. Instructions for how to collect and inject eggs with beveled needles are described. This relatively straightforward technique is flexible and potentially adaptable to other insects. One can gather and inject dozens of eggs in a single experiment, and survival rates for buffer-only injections improve with practice and can be as high as 80%. This technique will support several types of experimental approaches including injection of pharmacological agents, in vitro capped mRNA to express genes of interest, double-stranded RNA (dsRNA) to achieve RNA interference, use of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) in concert with CRISPR-associated protein 9 (Cas9) reagents for genomic modification, and transposable elements to generate transient or stable transgenic lines.

Injecting Gryllus bimaculatus Eggs

Here we present a protocol to inject cricket eggs, a technique which serves as a foundational method in many experiments in the cricket, including, but not limited to, RNA interference and genomic manipulation.

Inyección de huevos de Gryllus bimaculatus

Altering gene function in a developing organism is central to different kinds of experiments. While tremendously powerful genetic tools have been ...

Biología del Desarrollo

Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera (H&#252;bner)

The cotton bollworm, Helicoverpa armigera, is one of the most destructive pests in the world. A combination of molecular genetics, physiology, functional genomics, and behavioral studies has made H. armigera a model species in Lepidoptera Noctuidae. To study the in vivo functions of and interactions between different genes, clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/ associated protein 9 (Cas9) genome editing technology is a convenient and effective method used for performing functional genomic studies. In this study, we provide a step-by-step systematic method to complete gene knockout in H. armigera using the CRISPR/Cas9 system. The design and synthesis of guide RNA (gRNA) are described in detail. Then, the subsequent steps consisting of gene-specific primer design for guide RNA (gRNA) creation, embryo collection, microinjection, insect rearing, and mutant detection are summarized. Finally, troubleshooting advice and notes are provided to improve the efficiency of gene editing. Our method will serve as a reference for the application of CRISPR/Cas9 genome editing in H. armigera as well as other Lepidopteran moths.

Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera H&#252;bner

Presented here is a protocol of Helicoverpa armigera (H&#252;bner) embryo microinjection and knockout mutant identification created by CRISPR/Cas9 genome editing. Mutant insects enable further research of gene function and interaction among different genes in vivo.

Microinyección embrionaria e identificación de mutantes knockout de Helicoverpa armigera editada por el genoma CRISPR/Cas9 (Hübner)

The cotton bollworm, Helicoverpa armigera, is one of the most destructive pests in the world. A combination of molecular genetics, physiology, functional ...

Comportamiento

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although RNA interference (RNAi) has proved to be a powerful tool for studying WCR biology, it has its limitations. Specifically, RNAi itself is transient (i.e. does not result in long-term Mendelian inheritance of the associated phenotype), and it requires knowing the DNA sequence of the target gene. The latter can be limiting if the phenotype of interest is controlled by poorly conserved, or even novel genes, because identifying useful targets would be challenging, if not impossible. Therefore, the number of tools in WCR&#39;s genomic toolbox should be expanded by the development of methods that could be used to create stable mutant strains and enable sequence-independent surveys of the WCR genome. Herein, we detail the methods used to collect and microinject precellular WCR embryos with nucleic acids. While the protocols described herein are aimed at the creation of transgenic WCR, CRISPR/Cas9-genome editing could also be performed using the same protocols, with the only difference being the composition of the solution injected into the embryos.

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Here we present protocols for collecting and microinjecting precellular western corn rootworm embryos for the purpose of performing functional-genomic assays such as germline transformation and CRISPR/Cas9-genome editing.

Microinyección de Western gusano de raíz del maíz, Diabrotica virgifera virgifera, embriones para transformación de línea germinal, o edición del genoma CRISPR/Cas9

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

Bioingeniería

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

The corn planthopper, Peregrinus maidis, is&#160;a pest of maize and a vector of several maize viruses. Previously published methods describe the triggering of RNA interference (RNAi) in P. maidis through microinjection of double-stranded RNAs (dsRNAs) into nymphs and adults. Despite the power of RNAi, phenotypes generated via this technique are transient and lack long-term Mendelian inheritance. Therefore, the P. maidis toolbox needs to be expanded to include functional genomic tools that would enable the production of stable mutant strains, opening the door for researchers to bring new control methods to bear on this economically important pest. However, unlike the dsRNAs used for RNAi, the components used in CRISPR/Cas9-based genome editing and germline transformation do not easily cross cell membranes. As a result, plasmid DNAs, RNAs, and/or proteins must be microinjected into embryos before the embryo cellularizes, making the timing of injection a critical factor for success. To that end, an agarose-based egg-lay method was developed to allow embryos to be harvested from P. maidis females at relatively short intervals. Herein are provided detailed protocols for collecting and microinjecting precellular P. maidis embryos with CRISPR components (Cas9 nuclease that has been complexed with guide RNAs), and results of Cas9-based gene knockout of a P. maidis eye-color gene, white, are presented. Although these protocols describe CRISPR/Cas9-genome editing in P. maidis, they can also be used for producing transgenic P. maidis via germline transformation by simply changing the composition of the injection solution.

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

Herein are protocols for collecting and microinjecting precellular corn planthopper embryos for the purpose of modifying their genome via CRISPR/Cas9-based genome editing or for the addition of marked transposable elements through germline transformation.

Microinyección de saltamontes de maíz, Peregrinus maidis, embriones para la edición del genoma CRISPR/Cas9

The corn planthopper, Peregrinus maidis, is&#160;a pest of maize and a vector of several maize viruses. Previously published methods describe the ...

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, host-symbiont interactions, speciation, and venom synthesis. Despite the availability of several molecular tools, including CRISPR/Cas9, functional genetic studies are still limited in this organism. The major limitation of applying CRISPR/Cas9 technology in N. vitripennis stems from the challenges of embryonic microinjections. Injections of embryos are particularly difficult in this organism and in general in many parasitoid wasps, due to small embryo size and the requirement of a host pupa for embryonic development. To address these challenges, Cas9 ribonucleoprotein complex delivery into female&#160;ovaries by adult injection, rather than embryonic microinjection, was optimized, resulting in both somatic and heritable germline edits. The injection procedures were optimized in pupae and female wasps using either ReMOT Control (Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo) or BAPC (Branched Amphiphilic Peptide Capsules). These methods are shown to be effective alternatives to embryo injection, enabling site-specific and heritable germline mutations.

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Here, we describe methods for efficient pupal and adult injections in Nasonia vitripennis as accessible alternatives to embryo microinjection, enabling functional analysis of genes of interest using either RNA-silencing via RNA interference (RNAi) or gene knockout via CRISPR/Cas9 genome editing.

Inyecciones pupales y para adultos para RNAi y edición de genes CRISPR en Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, ...

Biología

Hyperactive piggyBac Transposase-mediated Germline Transformation in the Fall Armyworm, Spodoptera frugiperda

Stable insertion of genetic cargo into insect genomes using transposable elements is a powerful tool for functional genomic studies and developing genetic pest management strategies. The most used transposable element in insect transformation is piggyBac, and piggyBac-based germline transformation has been successfully conducted in model insects. However, it is still challenging to employ this technology in non-model insects that include agricultural pests. This paper reports on germline transformation of a global agricultural pest, the fall armyworm (FAW), Spodoptera frugiperda, using the hyperactive piggyBac transposase (hyPBase).
In this work, the hyPBase mRNA was produced and used in place of helper plasmid in embryo microinjections. This change led to the successful generation of transgenic FAW. Furthermore, the methods of screening transgenic animals, PCR-based rapid detection of transgene insertion, and thermal asymmetric interlaced PCR (TAIL-PCR)-based determination of the integration site, are also described. Thus, this paper presents a protocol to produce transgenic FAW, which will facilitate piggyBac-based transgenesis in FAW and other lepidopteran insects.

Hyperactive piggyBac Transposase-mediated Germline Transformation in the Fall Armyworm, Spodoptera frugiperda

Successful germline transformation in the fall armyworm, Spodoptera frugiperda, was achieved using mRNA of hyperactive piggyBac transposase.

PiggyActivoBac Transformación de la línea germinal mediada por transposasa en el gusano cogollero, Spodoptera frugiperda

Stable insertion of genetic cargo into insect genomes using transposable elements is a powerful tool for functional genomic studies and developing genetic ...