To et TD ont été soutenus par les numéros de subvention JSPS KAKENHI 19H02970 et 20H02999, respectivement.

1. Maintien des colonies de laboratoire
<ol><li>Pour le maintien des populations sauvages et mutantes, utilisez un grand contenant en plastique (460 mm x 360 mm x 170 mm) avec des aliments artificiels réguliers pour le poisson, de l’eau dans des tasses en plastique avec un trou de ventilation sur le dessus, un papier plié pour cacher les insectes et du coton superposé pour pondre desœufs ( figure 2A). Gardez toutes les cultures T. domestica à l’intérieur des incubateurs de 37 °C et réglez l’humidité relative (HR) à l’intérieur de chaque récipient à 60%-80%. REMARQUE : Étant donné que T. domestica absorbe la vapeur d’eau de l’atmosphère11,un approvisionnement direct en eau n’est pas nécessaire. L’HR approprié est maintenu en raison de la présence de vapeur d’eau provenant de gobelets en plastique contenant un trou de ventilation sur le dessus ou de tasses sans couvercle à l’intérieur de chaque récipient. Il n’est pas nécessaire d’humidifier à l’intérieur d’un incubateur entier qui contient des cultures. La durée approximative de chaque étape du développement dans la condition décrite dans ce protocole est indiquée à la figure 1. La vitesse de développement pourrait être ajustée en changeant la température et/ou rh12.</li>
	<li>Ajouter les aliments périodiquement. Ajouter l’eau avant qu’elle ne sèche.</li>
	<li>Transférer les populations dans un nouveau contenant propre au moins tous les 3 mois étant donné que les adultes cessent de pondre dans un environnement sale et/ou une population dense (voir Discussion).</li>
</ol>2. Collecte et microinjection d’oeufs
<ol><li>Concevoir un guide ARN (gRNA)<ol>
<li>Concevoir une séquence d’ARNg pour chaque cible requise et BLAST les séquences d’ARN g contre l’assemblage du génome pour vérifier les sites de reconnaissance hors cible possibles.</li>
		<li>Synthétiser et purifier les ARN selon les instructions du fabricant8. REMARQUE : À titre d’exemple, dans le cas du ciblage du gène blanc du transporteur de cassettes liant l’ATP, une séquence cible de 20 points de base a été conçue et deux oligonucléotides d’ADN synthétisés 5'-TAATACGACTCACTATAGTGTGTGTGTGGGAC-3' et 5'-TTCTAGCTTATAAAACATCGGTCCCAACACTTA-3' ont été commandés. Le modèle d’ADN a été préparé en annelant ces deux oligonucléotides suivis de l’amplification de PCR et le gRNA est alors transcrit in vitro du modèle avec une polymésexase d’ARN T7.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparer des colonies de collecte d’œufs<ol>
<li>Transférer environ 20 adultes mâles et 20 femelles dans un récipient de taille moyenne (200 mm x 150 mm x 90 mm) avec de la nourriture, de l’approvisionnement en eau, un papier plié et un petit morceau de coton superposé pour la ponte (figure 2B).</li>
		<li>Mettre en place plusieurs colonies pour obtenir un grand nombre d’embryons mis en scène dans un court laps de temps à utiliser pour l’édition du génome. REMARQUE : On s’attend à ce qu’environ 20 à 40 œufs soient prélevés dans une colonie après 8 h à 37 °C. Il faut habituellement quelques jours aux adultes transférés pour commencer à pondre des œufs, peut-être en raison de l’adaptation à un nouvel environnement.</li>
	</ol></li>
	<li>Le jour de l’injection, remplacer le coton à l’intérieur des contenants par de nouveaux.</li>
	<li>Placez une bande à double face de 76 mm x 5 mm sur une glissière en verre ordinaire de 76 mm x 26 mm.</li>
	<li>Huit heures plus tard, recueillir les œufs du coton en couches en séparant les couches à l’aide de forceps.</li>
	<li>Alignez les œufs sur le ruban à double face à l’aide d’un pinceau humide et gardez une distance de 2 mm entre les œufs. Tous les oeufs doivent être orientés de sorte que l’axe longitudinal d’un œuf fait face au côté injection (figure 3A). Presser doucement les œufs à l’aide d’un pinceau pour tenir fermement pendant l’injection. REMARQUE : Dans ce protocole, le champignon pousse rapidement dans les œufs injectés endommagés dans un état humide et chaud. Il est important de garder la distance entre les œufs pour prévenir la contamination croisée et l’expansion du champignon.</li>
	<li>Mélanger l’ARN et la protéine Cas9 à une concentration finale de 100 ng/μL et 500 ng/μL, respectivement. Utilisez de l’eau distillée pour la dilution. Incuber le mélange pendant 10 min à température ambiante pour favoriser la formation complexe de ribonucléoprotéines, puis garder le mélange sur la glace. REMARQUE : Un rouge neutre à une concentration finale de 1 % pourrait être ajouté à la solution d’injection pour surveiller la quantité injectée.</li>
	<li>Chargez 2 μL de la solution gRNA/Cas9 dans un capillaire d’injection de verre à l’aide d’un microchargeur. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air dans la solution avant l’injection. Si nécessaire, appuyez sur l’aiguille pour enlever les bulles. REMARQUE : Dans cette expérience, une aiguille prête à l’herbe est utilisée pour obtenir une pointe d’aiguille fine (figure 3B). Une aiguille maison avec une forme similaire pourrait être utilisée à la place.</li>
	<li>Fixez le capillaire d’injection de verre, précédemment chargé de la solution gRNA/Cas9, à un support équipé d’un manipulateur et connectez le support à un microinjecteur électronique.</li>
	<li>Optimisez la forme de la pointe de l’aiguille en la cassant légèrement avec des forceps pour éviter l’engorgement et obtenir une meilleure durabilité tout au long d’une série d’injections (un exemple d’aiguille appropriée est indiqué dans la figure 3C). REMARQUE : Il est recommandé de changer une aiguille lorsqu’elle est obstruée. Il est possible de continuer à injecter avec la même aiguille si elle est brisée à nouveau avec des forceps, mais une pointe plus large conduit à plus de dommages aux œufs et abaisse leur taux de survie. Comme les œufs de T. domestica sont mous et fragiles, il est essentiel de garder une pointe d’aiguille fine pour avoir un taux de survie élevé après l’injection.</li>
	<li>Insérez l’aiguille au milieu de l’axe longitudinal d’un œuf et injectez une légère quantité de la solution (voir la figure 3D-H pour référence sur la quantité d’injection). Ajustez la configuration du microinjecteur électronique pendant l’injection, en fonction de la forme de la pointe de l’aiguille. REMARQUE : Il est recommandé d’appliquer une pression constante pendant l’injection, sinon le contenu collant d’oeuf peut facilement couler dans l’aiguille en verre et peut l’obstruer. La solution peut être soit d’injecter avec une impulsion de pression courte ou avec une pression constante, selon la quantité de liquide injecté. Gardez à l’esprit que lorsqu’une pointe d’aiguille a une ouverture large, trop de solution est injectée dans un œuf, ce qui provoque la létalité (Figure 3F-H). Dans ce cas, maintenez un flux liquide constant par pression constante, puis insérez l’aiguille dans un œuf et retirez-la immédiatement. S’il provoque trop de débordement ou que l’œuf éclate, changer l’aiguille.</li>
	<li>Gardez les oeufs injectés dans un récipient avec la taille appropriée pour le nombre d’oeufs injectés (<20 oeufs: petit plat; >20 oeufs: récipient de taille moyenne) avec 60%-80% RH et 37 °C.</li>
</ol>3. Accouplement
<ol><li>Vérifiez périodiquement les œufs injectés et jetez les œufs endommagés avec des forceps pour éviter la croissancefongique( Figure 3I,J). Dans le cas où trop de champignon pousse sur un œuf, nettoyer la surface de l’œuf avec 70% EtOH.</li>
	<li>Avant l’éclosion (environ 10 jours à 37 °C après la ponte), tremper la glissade de verre avec les œufs injectés dans de la poudre de talc pour enrober la surface du ruban adhésif à double face. Cela permettra d’éviter l’empilement de nymphes écloses. Transférez les glissières en verre enduites de poudre dans un récipient de taille moyenne avec de la nourriture, de l’eau et un papier plié pour cacher les insectes.</li>
	<li>Retirez les glissières de verre après l’éclosion des nymphes. Fournissez périodiquement de la nourriture jusqu’à ce qu’ils atteignent l’âge adulte. REMARQUE : Il faut environ 2,0 à 2,5 mois pour que les individus atteignent l’âge adulte après leur éclosion (figure 1A). Le stade adulte est jugé sur la base d’un ovipositeur bien développé chez les femelles (Figure 1B).</li>
	<li>Pour accoupler les individus, transférez autant d’adultes femelles de type sauvage que nécessaire d’une colonie de laboratoire au récipient de taille moyenne et incubez-les pendant au moins 14 jours à 37 °C pour s’assurer qu’ils sont vierges. REMARQUE : Il n’est pas nécessaire de recueillir les femelles vierges d’une colonie de laboratoire parce que les T. domestica adultes ont un cycle répété de mue et d’accouplement appelé « cycle reproducteur et muant », au cours duquel les femelles jettent le sperme avec chaque mue et s’accouplent à nouveau dans le prochain cycle de fécondation13.</li>
	<li>Transférer un adulte G0 mâle ou femelle qui s’est développé à partir d’un œuf injecté et d’un adulte sauvage à un petit plat en plastique (Ø 100 mm x 40 mm) avec de la nourriture, un papier plié et un petit morceau de coton pour pondre des œufs G1(figure 2C'; plat d’accouplement). Gardez les plats d’accouplement dans un plus grand récipient avec 60%-80% RH (Figure 2C). REMARQUE : Plusieurs adultes de type sauvage peuvent être inclus dans un plat pour augmenter les chances de succès de l’accouplement, bien que des taux de réussite élevés aient été atteints avec l’appariement en un à un.</li>
</ol>4. Genotyping
<ol><li>Concevoir des paires d’amorce PCR pour chaque rRNA pour amplifier un produit de 100-200 bp qui inclut le site ciblé par l’ARNm. BLAST chaque séquence d’amorce contre l’assemblage du génome pour vérifier sa spécificité (un exemple est montré pour le ciblage du gène blanc dans la figure 4A).</li>
	<li>Vérifiez la transformation germinale des adultes G0.<ol>
<li>Cinq jours après la ponte, recueillir les œufs G1 individuels de chaque paire adulte G0 dans des tubes de 0,2 mL (un œuf par tube; conserver les échantillons recueillis à -20 °C pour un stockage à long terme). Séparer les couches de coton pour recueillir les œufs. REMARQUE : Il est recommandé de génotyper au moins 12 nymphes G1 de chaque paire d’accouplement pour évaluer le succès de la transmission germinale (voir Résultats représentatifs).</li>
		<li>Ajouter 15 μL d’une solution Proteinase K de 0,25 mg/mL (dissoute dans le tampon Tris-EDTA) à chaque tube, homogénéiser brièvement les échantillons avec des cure-dents et incuber à 55 °C pendant 3 à 16 h.</li>
		<li>Inactivez la Proteinase K en plaçant les échantillons à 95 °C pendant 10 min.</li>
		<li>Ajouter 90 μL d’eau distillée à chaque tube et bien mélanger. Utilisez 2 μL de supernatant dans un mélange de réaction PCR de 10 μL contenant les amorces conçues à l’étape 4.1. REMARQUE : L’utilisation d’une polymése d’ADN optimisée pour les modèles bruts est recommandée pour atteindre suffisamment d’amplification PCR.</li>
		<li>Pour analyser les produits PCR, effectuez un test de mobilité hétéroduplexe (HMA) avec un système d’électrophoresis à micropuces(figure 3B; voir Ohde et coll., 2018)8. REMARQUE : Les mutations pourraient être évaluées avec deux méthodes alternatives : (1) HMA avec des polymères de gel standard, tels que 8% polyacrylamide14; (2) digestion des produits PCR avec endonuclease T7 suivie d’électrophoresis gel agarose15.</li>
		<li>Ne gardez que les nymphes G1 résultant d’adultes G0 qui contiennent des mutations dans leur lignée germinale et jetez les autres.</li>
	</ol></li>
	<li>Génotypage individuel des nymphes/adultes G1<ol>
<li>Isoler les nymphes G1 dans des assiettes de 24 puits à l’aide d’un aspirateur ou d’un pinceau. Placez les plaques de 24 puits dans un récipient plus grand (p. ex., le contenant de taille moyenne utilisé dans ce protocole) avec l’approvisionnement en eau tel que décrit ci-dessus pour maintenir une HR de 60 % à 80 %(figure 1D). Maintenir l’approvisionnement en nourriture artificielle de poisson ordinaire(figure 1D'). NOTE : Bien que cette étape puisse être exécutée à n’importe quel point des étapes nymphales et adultes, il est recommandé de l’exécuter après avoir atteint l’âge adulte et juste avant l’appariement (>2.5 mois après injection ; Figure 1B) parce qu’il est plus facile de maintenir les firebrats dans un grand récipient. L’élevage individuel est nécessaire pour suivre le génotype de chaque nymphe G1 sur les étapes suivantes. Les nymphes G1 du même adulte G0 peuvent avoir des mutations différentes.</li>
		<li>Pincez et tirez le cerci et le filament caudal d’une nymphe/adulte à l’aide de forceps et recueillez-les dans un tube de 0,2 mL contenant 50 μL EtOH (stockez les échantillons recueillis à -20 °C pour un stockage à long terme). REMARQUE : Des échantillons de tissus sont prélevés dans EtOH parce qu’ils empêchent la perte de ces petits échantillons en raison de l’électricité statique. Si l’on a besoin d’arrêter le mouvement des insectes, anesthésier nymphe / adulte sur la glace lors de la prise d’échantillons de tissus. Comme T. domestica ne peut survivre après un refroidissement à long terme sur la glace, ne les anesthésiez pas pendant plus d’une minute et déplacez-les immédiatement à la température ambiante. L’ablation du cerci et du filament caudal ne provoque aucune augmentation de la mortalité.</li>
		<li>Placez les tubes d’échantillon avec les couvercles ouverts sur un bloc thermique pendant 15 min à 70 °C pour évaporer l’EtOH.</li>
		<li>Répétez les étapes 4.2.2-4.2.5 pour le génotypage.</li>
		<li>Soumettez les produits PCR dans lesquels un modèle de bande mutante est observé à un service de séquençage Sanger standard.</li>
		<li>Gardez les nymphes/adultes G1 avec les mutations désirées et jetez les autres (voir la figure 4C pour un résultat représentatif de séquençage).</li>
	</ol></li>
	<li>Croisez les adultes contenant les mutations désirées dans un plat d’accouplement et obtenez les générations suivantes pour établir une souche mutante homozygote.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Peterson, M. D., Rogers, B. T., Popadi&#263;, A., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+expression+pattern+of+labial,+posterior+homeotic+complex+genes+and+the+teashirt+homologue+in+an+apterygote+insect.">The embryonic expression pattern of labial, posterior homeotic complex genes and the teashirt homologue in an apterygote insect.</a> Development Genes and Evolution. 209, 77-90 (1999).</li><li>Farris, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+organization+of+the+mushroom+bodies+of+Thermobia+domestica+(Zygentoma,+Lepismatidae):+Insights+into+mushroom+body+evolution+from+a+basal+insect.">Developmental organization of the mushroom bodies of Thermobia domestica (Zygentoma, Lepismatidae): Insights into mushroom body evolution from a basal insect.</a> Evolution and Development. 7, 150-159 (2005).</li><li>Kamae, Y., Tanaka, F., Tomioka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+and+functional+analysis+of+the+clock+genes,+Clock+and+cycle,+in+the+firebrat+Thermobia+domestica.">Molecular cloning and functional analysis of the clock genes, Clock and cycle, in the firebrat Thermobia domestica.</a> Journal of Insect Physiology. 56, 1291-1299 (2010).</li><li>Ohde, T., Masumoto, M., Yaginuma, T., Niimi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+RNAi+analysis+in+the+firebrat,+Thermobia+domestica:+Distal-less+is+required+to+form+caudal+filament.">Embryonic RNAi analysis in the firebrat, Thermobia domestica: Distal-less is required to form caudal filament.</a> Journal of Insect Biotechnology and Sericology. 105, 99-105 (2009).</li><li>Ohde, T., Yaginuma, T., Niimi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nymphal+RNAi+analysis+reveals+novel+function+of+scalloped+in+antenna,+cercus+and+caudal+filament+formation+in+the+firebrat,+Thermobia+domestica.">Nymphal RNAi analysis reveals novel function of scalloped in antenna, cercus and caudal filament formation in the firebrat, Thermobia domestica.</a> Journal of Insect Biotechnology and Sericology. 108, 101-108 (2012).</li><li>Bell&#233;s, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+Drosophila:+RNAi+in+vivo+and+functional+genomics+in+insects.">Beyond Drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects.</a> Annual Review of Entomology. 55, 111-128 (2010).</li><li>Ohde, T., Takehana, Y., Shiotsuki, T., Niimi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-based+heritable+targeted+mutagenesis+in+Thermobia+domestica:+A+genetic+tool+in+an+apterygote+development+model+of+wing+evolution.">CRISPR/Cas9-based heritable targeted mutagenesis in Thermobia domestica: A genetic tool in an apterygote development model of wing evolution.</a> Arthropod Structure and Development. 47, 362-369 (2018).</li><li>Nji, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+insects:+Applications,+best+practices+and+biosafety+concerns.">CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns.</a> Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).</li><li>Brand, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+the+odorant+receptor+gene+family+in+insects.">The origin of the odorant receptor gene family in insects.</a> eLife. 7, 1-13 (2018).</li><li>Noble-Nesbitt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+balance+in+the+firebrat,+Thermobia+domestica+(Packard).+Exchanges+of+water+with+the+atmosphere.">Water balance in the firebrat, Thermobia domestica (Packard). Exchanges of water with the atmosphere.</a> Journal of Experimental Biology. 50, 745-769 (1969).</li><li>Sweetman, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+ecology+of+the+firebrat,+Thermobia+domestica+(Packard).">Physical ecology of the firebrat, Thermobia domestica (Packard).</a> Ecological Monographs. 8, 285-311 (1938).</li><li>Nijhout, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Insect Hormones. , (1994).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+detection,+quantification+and+enrichment+of+subtle+allelic+alterations.">Efficient detection, quantification and enrichment of subtle allelic alterations.</a> DNA Research. 19, 423-433 (2012).</li><li>Mashal, R. D., Koontz, J., Sklar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+mutations+by+cleavage+of+DNA+heteroduplexes+with+bacteriophage+resolvases.">Detection of mutations by cleavage of DNA heteroduplexes with bacteriophage resolvases.</a> Nature Genetics. 9, 177-183 (1995).</li><li>Adams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+notes+upon+the+firebrat,+Thermobia+domestica+Packard.">Biological notes upon the firebrat, Thermobia domestica Packard.</a> Journal of the New York Entomological Society. 41, 557-562 (1933).</li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Pour la génération réussie du mutant T. domestica désiré avec CRISPR/Cas9, il est d’abord important de recueillir un nombre suffisant d’embryons mis en scène pour injection. Pour une collecte constante d’un nombre suffisant d’œufs T. domestica, la clé est de sélectionner une taille appropriée du récipient pour avoir une densité de population inférieure, car elle aiderait à l’achèvement réussi d’une série de comportements complexes d’accouplement, qui se répète après cha...

Thermobia domestica appartient à l’un des ordres d’insectes les plus basiques, Zygentoma, qui conserve un cycle de vie ancestral amétabolique et sans ailes. Cette position phylogénétique basale et ses caractéristiques ancestrales placent cette espèce comme un modèle attrayant pour l’étude des mécanismes sous-jacents au succès des insectes sur Terre, qui couvrent plus de 70 % des espèces animalesdécrites 1. T. domestica a longtemps été utilisé principalement pour étudier les caractéristiques ancestrales de la physiologie des insectes en raison de ses caractéristiques appropriées en tant que modèle de laboratoire, comme un cycle de vie relativement court (2,5-3,0 mois de l’embryon à l’adulte reproducteur; Figure 1A) et une reproduction facile. Au cours des trois dernières décennies, son utilisation a été élargie pour étudier les caractéristiques ancestrales de divers traits tels que le plan corporel, la différenciation neuronale et les rythmescircadiens 2,3,4.
L’application d’outils génétiques avancés dans T. domestica pourrait encore accélérer ces contributions dans un vaste domaine de recherche. L’interférence réussie d’ARN (RNAi)-2-2meint le renversement de gène dans les embryons, les nymphes, et les adultes a été rapporté dans T. domestica4,5,6. L’efficacité de l’ARNi systémique est encore fortement tributaire des espèces — par exemple, elle est généralement élevée chez les coléoptères alors qu’elle est faible dans l’ordre des lépidoptères7. L’efficacité et la durée du renversement du RNAi à T. domestica n’ont pas encore été évaluées. En plus de RNAi, nous avons précédemment rapporté un succès CRISPR/Cas9-19-20 knockout gène dans T. domestica8. Le système CRISPR/Cas a été largement appliqué pour l’édition du génome chez les insectes en particulier pour les knockout génétiques ciblés. Son utilisation pourrait être étendue pour d’autres applications telles que l’analyse de journaliste de gène, le suivi de lignée cellulaire, et la manipulation de l’activité transcriptionnelle en frappant-dans les constructions exogènes après l’établissement d’un protocole pour livrer des composants du système CRISPR/Cas dans les noyaux9. Combinée à l’assemblage dugénome publié 10, l’utilisation à grande échelle et le développement ultérieur de l’édition du génome crispr/cas dans T. domestica faciliteraient des études axées sur les mécanismes évolutifs derrière le succès adaptatif exceptionnel des insectes. Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour la microinjection embryonnaire et pour l’accouplement adulte T. domestica pour générer une souche mutante à l’aide de CRISPR/Cas9. Compte tenu de cette nouvelle méthode, nous discutons de l’importance de considérer la biologie unique des espèces modèles non traditionnelles pour des applications réussies de ces techniques.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>83-3738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3, 100 &#181;g</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>1081060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-static cleaner</td>
			<td>Hozan</td>
			<td>Z-292</td>
			<td>for removing static electricity from a 24-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barrier Box 20.7L</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>4-5606-01</td>
			<td>Large container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FemtoJet 4i</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5252000013</td>
			<td>Electronic microinjector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtotip II, injection capillary</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242957000</td>
			<td>Glass injection capillary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Pack 2440mL</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>5-068-25</td>
			<td>Middle-sized container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MIR-554-PJ</td>
			<td>for 37 &#176;C incubation. No need to humidify inside the incubator.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOD Fx Neo</td>
			<td>Toyobo</td>
			<td>KFX-101</td>
			<td>PCR enzyme for genotyping. Optimized for an amplification from crude templates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GJ-8</td>
			<td>for holding the micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MM-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX12</td>
			<td>for microinjection. More than 35X magnification is sufficient for the microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiNA</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>MCE-202</td>
			<td>Microchip electrophoresis system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NiceTac</td>
			<td>Nichiban</td>
			<td>NW-5</td>
			<td>Double-sided tape to place eggs on a glass slide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint brush (horse hair)</td>
			<td>Pentel</td>
			<td>ZBS1-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant culture dish</td>
			<td>SPL Life Sciences</td>
			<td>310100</td>
			<td>Mating dish and water supplies for a large and middle-sized containers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K, recombinant, PCR Grade Lyophilizate from Pichia pastoris</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3115836001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SZX 12 microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX 12</td>
			<td>More than 35X magnification is sufficient for the microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talcum powder</td>
			<td>Maruishi</td>
			<td>877113</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetra Goldfish Gold Growth</td>
			<td>Spectrum Brands</td>
			<td></td>
			<td>Artificial regular fish food</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

egg microinjection and efficient mating for genome editing in the firebrat thermobia domestica

Le firebrat Thermobia domestica est une espèce amétabolique et sans ailes qui convient à l’étude des mécanismes de développement des insectes qui ont mené à leur rayonnement évolutif réussi sur la terre. L’application d’outils génétiques tels que l’édition du génome est la clé pour comprendre les changements génétiques qui sont responsables des transitions évolutionnaires dans une approche Evo-Devo. Dans cet article, nous décrivons notre protocole actuel pour générer et maintenir des souches mutantes de T. domestica. Nous rapportons une méthode d’injection sèche, comme alternative à la méthode d’injection humide rapportée, qui nous permet d’obtenir des taux de survie sensiblement élevés dans les embryons injectés. Nous signalons également un environnement optimisé pour accoupler les adultes et obtenir les générations suivantes avec une grande efficacité. Notre méthode souligne l’importance de tenir compte de la biologie unique de chaque espèce pour l’application réussie des méthodes d’édition du génome aux organismes modèles non traditionnels. Nous prévoyons que ces protocoles d’édition du génome aideront à mettre en œuvre T. domestica en tant que modèle de laboratoire et à accélérer davantage le développement et l’application d’outils génétiques utiles chez cette espèce.

Dans nos mains, environ 100 oeufs peuvent être bien injectés avec un capillaire à injection unique quand il a la pointe adéquate (Figure 3C). L’injection du complexe de ribonucleoprotein de gRNA/Cas9 dans les embryons dans les 8 premières h après la ponte a comme résultat des indélébiles au site visé de gRNA. Cela provoque des mutations bialéliques dans certaines cellules de la génération injectée (G0) et donc des phénotypes de mosaïque mutante sont généralement obtenus e...

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Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

Nous fournissons un protocole détaillé pour l’élevage, la microinjection des œufs et pour l’accouplement efficace du firebrat Thermobia domestica pour générer et maintenir des souches mutantes après l’édition du génome.

Microinjection d’oeufs et accouplement efficace pour l’édition du génome dans le Firebrat Thermobia domestica

The firebrat Thermobia domestica is an ametabolous, wingless species that is suitable for studying the developmental mechanisms of insects that led to ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

4.3K vues.  Kyoto University. Nous fournissons un protocole détaillé pour l’élevage, la microinjection des œufs et pour l’accouplement efficace du firebrat Thermobia domestica pour générer et maintenir des souches mutantes après l’édition du génome.

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Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Analyse des Muscle intégrité poisson zèbre larves squelettique avec colorant bleu Evans

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Recherche

Biologie du développement

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus embryos are large, develop externally, and can be easily manipulated by microinjection or surgical procedures. In addition, fate maps have been established for early Xenopus embryos. Targeted microinjection into the individual blastomere that will eventually give rise to an organ or tissue of interest can be used to selectively overexpress or knock down gene expression within this restricted region, decreasing secondary effects in the rest of the developing embryo. In this protocol, we describe how to utilize established Xenopus fate maps to target the developing Xenopus kidney (the pronephros), through microinjection into specific blastomere of 4- and 8-cell embryos. Injection of lineage tracers allows verification of the specific targeting of the injection. After embryos have developed to stage 38 - 40, whole-mount immunostaining is used to visualize pronephric development, and the contribution by targeted cells to the pronephros can be assessed. The same technique can be adapted to target other tissue types in addition to the pronephros.

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

Technique à la cible microinjection du Developing<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Identification of Critical Conditions for Immunostaining in the Pea Aphid Embryos: Increasing Tissue Permeability and Decreasing Background Staining

The pea aphid Acyrthosiphon pisum, with a sequenced genome and abundant phenotypic plasticity, has become an emerging model for genomic and developmental studies. Like other aphids, A. pisum propagate rapidly via parthenogenetic viviparous reproduction, where the embryos develop within egg chambers in an assembly-line fashion in the ovariole. Previously we have established a robust platform of whole-mount in situ hybridization allowing detection of mRNA expression in the aphid embryos. For analyzing the expression of protein, though, established protocols for immunostaining the ovarioles of asexual viviparous aphids did not produce satisfactory results. Here we report conditions optimized for increasing tissue permeability and decreasing background staining, both of which were problems when applying established approaches. Optimizations include: (1) incubation of proteinase K (1 &#181;g/ml, 10 min), which was found essential for antibody penetration in mid- and late-stage aphid embryos; (2) replacement of normal goat serum/bovine serum albumin with a blocking reagent supplied by a Digoxigenin (DIG)-based buffer set and (3) application of methanol rather hydrogen peroxide (H2O2) for bleaching endogenous peroxidase; which significantly reduced the background staining in the aphid tissues. These critical conditions optimized for immunostaining will allow effective detection of gene products in the embryos of A. pisum and other aphids.

A protocol of whole-mount immunostaining on aphid embryos is presented, in which critical conditions for decreasing background staining and increasing tissue permeability are addressed. These conditions are specifically developed for effective detection of protein expression in the embryonic tissues of aphids.

Identification des conditions critiques pour Immunocoloration dans le puceron du pois embryons: L&#39;augmentation de la perméabilité des tissus et la diminution de la coloration de fond

The pea aphid Acyrthosiphon pisum, with a sequenced genome and abundant phenotypic plasticity, has become an emerging model for genomic and developmental ...

Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and behavioral phenotypes. The remarkably diverse phenotypes that have evolved as marine populations adapt to countless freshwater environments, combined with the ability to cross marine and freshwater forms, provide a rare vertebrate system in which genetics can be used to map genomic regions controlling evolved traits. Excellent genomic resources are now available, facilitating molecular genetic dissection of evolved changes. While mapping experiments generate lists of interesting candidate genes, functional genetic manipulations are required to test the roles of these genes. Gene regulation can be studied with transgenic reporter plasmids and BACs integrated into the genome using the Tol2 transposase system. Functions of specific candidate genes and cis-regulatory elements can be assessed by inducing targeted mutations with TALEN and CRISPR/Cas9 genome editing reagents. All methods require introducing nucleic acids into fertilized one-cell stickleback embryos, a task made challenging by the thick chorion of stickleback embryos and the relatively small and thin blastomere. Here, a detailed protocol for microinjection of nucleic acids into stickleback embryos is described for transgenic and genome editing applications to study gene expression and function, as well as techniques to assess the success of transgenesis and recover stable lines.

Transgenic manipulations and genome editing are critical for functionally testing the roles of genes and cis-regulatory elements. Here a detailed microinjection protocol for the generation of genomic modifications (including Tol2-mediated fluorescent reporter transgene constructs, TALENs, and CRISPRs) is presented for the emergent model fish, the threespine stickleback.

Microinjection pour transgénèse et Génome Édition dans Épinoche à trois épinoches

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance to man of conventional invertebrate model systems and the complexity of genomes in vertebrates are critical challenges to modeling human normal and pathological conditions. The chordate Ciona intestinalis is an invertebrate chordate that emerged from a common ancestor with the vertebrates and may represent features at the interface between invertebrates and vertebrates. A common body plan with much simpler cellular and genomic composition should unveil gene regulatory network (GRN) links and functional genomics readouts explaining phenomena in the vertebrate condition. The compact genome of Ciona, a fixed embryonic lineage with few divisions and large cells, combined with versatile community tools foster efficient gene functional analyses in this organism. Here, we present several crucial methods for this promising model organism, which belongs to the closest sister group to vertebrates. We present protocols for transient transgenesis by electroporation, along with microinjection-mediated gene knockdown, which together provide the means to study gene function and genomic regulatory elements. We extend our protocols to provide information on how community databases are utilized for in silico design of gene regulatory or gene functional experiments. An example study demonstrates how novel information can be gained on the interplay, and its quantification, of selected neural factors conserved between Ciona and man. Furthermore, we show examples of differential subcellular localization in embryonic cells, following DNA electroporation in Ciona zygotes. Finally, we discuss the potential of these protocols to be adapted for tissue specific gene interference with emerging gene editing methods. The in vivo approaches in Ciona overcome major shortcomings of classical model organisms in the quest of unraveling conserved mechanisms in the chordate developmental program, relevant to stem cell research, drug discovery, and subsequent clinical application.

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

We present transient transgenesis and gene knockdown in Ciona intestinalis, a chordate sister group to vertebrates, using microinjection and electroporation techniques. Such methods facilitate functional genomics in this simple invertebrate that features rudimentary characteristics of vertebrates, including notochord and head sensory epithelia, and many orthologs of human disease associated genes.

La micro-injection et l&#39;électroporation d&#39;embryons dans le chordés<em&gt; Ciona intestinalis</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

Collection of Post-mating Semen from the Female Reproductive Tract and Measurement of Semen Liquefaction in Mice

In mice, ejaculated semen is deposited in the uterus. After ejaculation, the semen changes consistency from gel-like to watery, a process called liquefaction. In this study, we show how to collect the post-ejaculated semen from the female reproductive tract in a mouse model. First, adult female mice in the estrus stage were housed in a male&#39;s cage overnight. The next morning, copulation was confirmed by the presence of copulatory plug at the vaginal opening. Female mice with copulatory plugs were euthanized, and each reproductive tract was collected as a whole (vagina, uterus, oviducts, ovaries), ensuring a closed system to contain the semen. The reproductive tract was placed in a 1.5 mL microcentrifuge tube, and the vagina was cut off to release the semen into the tube. To ensure maximum semen volume for analysis, toothless forceps were used to squeeze the uterine horns from ovarian end to vaginal end expelling remaining semen. The whole reproductive tract was then discarded. The semen-containing tube was briefly spun down. A 25 &#956;L capillary pipette was placed into the tube at a 180&#176; angle (parallel to the tube wall). The amount of time used to fill the capillary tube to the 25 &#956;L line was recorded. Semen from a proven male breeder usually takes approximately 60-180 s to fill a 25 &#956;L capillary tube. This semen collection technique can also be used in other downstream applications such as sperm imaging and motility analysis.

Semen liquefaction is required for sperm to be liberated from the seminal gel. This study provides the procedures for collecting semen from the female reproductive tract post-coitus, and measuring semen liquefaction time.

Collecte de sperme provenant de l’appareil reproducteur féminin et la mesure de la liquéfaction du sperme chez les souris après l’accouplement

In mice, ejaculated semen is deposited in the uterus. After ejaculation, the semen changes consistency from gel-like to watery, a process called ...

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of cells or tissues in model organisms. These systems contain two components as separate transgenic lines. A driver line expresses a transcriptional activator under the control of tissue-specific promoters/enhancers, and a reporter/effector line harbors a target gene placed downstream to the binding site of the transcription activator. Animals harboring both components induce tissue-specific transactivation of a target gene expression. Precise spatiotemporal expression of the gene in targeted tissues is critical for unbiased interpretation of cell/gene activity. Therefore, developing a method for generating exclusive cell/tissue-specific driver lines is essential. Here we present a method to generate highly tissue-specific targeted expression system by employing a &#34;Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat/CRISPR-associated&#34; (CRISPR/Cas)-based genome editing technique. In this method, the endonuclease Cas9 is targeted by two chimeric guide RNAs (gRNA) to specific sites in the first coding exon of a gene in the Drosophila genome to create double-strand breaks (DSB). Subsequently, using an exogenous donor plasmid containing the transactivator sequence, the cell-autonomous repair machinery enables homology-directed repair (HDR) of the DSB, resulting in precise deletion and replacement of the exon with the transactivator sequence. The knocked-in transactivator is expressed exclusively in cells where the cis-regulatory elements of the replaced gene are functional. The detailed step-by-step protocol presented here for generating a binary transcriptional driver expressed in Drosophila fgf/branchless-producing epithelial/neuronal cells can be adopted for any gene- or tissue-specific expression.

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

Here, we present a method for generating tissue-specific binary transcription systems in Drosophila by replacing the first coding exon of genes with transcription drivers. The CRISPR/Cas9-based method places a transactivator sequence under the endogenous regulation of a replaced gene, and consequently facilitates transctivator expression exclusively in gene-specific spatiotemporal patterns.

Une stratégie efficace pour générer des systèmes de Transcription binaire spécifique des tissus chez la drosophile par modification du génome

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a general challenge in developmental biology research. In the embryonic heart, this can be particularly difficult as regional differences in the expression of transcriptional regulators, paracrine/juxtacrine signaling cues, and hemodynamic force are all known to influence cardiomyocyte maturation. A simplified method to alter a developing cardiomyocyte's molecular and biomechanical microenvironment would, therefore, serve as a powerful technique to examine how local conditions influence cell fate and function. To address this, we have optimized a method to physically transplant juvenile cardiomyocytes into ectopic locations in the heart or the surrounding embryonic tissue. This allows us to examine how microenvironmental conditions influence cardiomyocyte fate transitions at single cell resolution within the intact embryo. Here, we describe a protocol in which embryonic myocytes can be isolated from a variety of cardiac sub-domains, dissociated, fluorescently labeled, and microinjected into host embryos with high precision. Cells can then be directly analyzed in situ using a variety of imaging and histological techniques. This protocol is a powerful alternative to traditional grafting experiments that can be prohibitively difficult in a moving tissue such as the heart. The general outline of this method can also be adapted to a variety of donor tissues and host environments, and its ease of use, low cost, and speed make it a potentially useful application for a variety of developmental studies.

In this method, embryonic cardiac tissues are surgically microdissected, dissociated, fluorescently labeled, and implanted into host embryonic tissues. This provides a platform for studying the individual or tissue level developmental organization under ectopic hemodynamic conditions, and/or altered paracrine/juxtacrine environments.

Microinjection-based System for In Vivo l’Implantation des Cardiomyocytes embryonnaires chez l’embryon aviaire

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Brain Organoid Generation from Induced Pluripotent Stem Cells in Home-Made Mini Bioreactors

The iPSC-derived brain organoid is a promising technology for in vitro modeling the pathologies of the nervous system and drug screening. This technology has emerged recently. It is still in its infancy and has some limitations unsolved yet. The current protocols do not allow obtaining organoids to be consistent enough for drug discovery and preclinical studies. The maturation of organoids can take up to a year, pushing the researchers to launch multiple differentiation processes simultaneously. It imposes additional costs for the laboratory in terms of space and equipment. In addition, brain organoids often have a necrotic zone in the center, which suffers from nutrient and oxygen deficiency. Hence, most current protocols use a circulating system for culture medium to improve nutrition.
Meanwhile, there are no inexpensive dynamic systems or bioreactors for organoid cultivation. This paper describes a protocol for producing brain organoids in compact and inexpensive home-made mini bioreactors. This protocol allows obtaining high quality organoids in large quantities.

Here we describe a protocol for generating brain organoids from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). To obtain brain organoids in large quantities and of high quality, we use home-made mini bioreactors.

Génération d’organoïdes cérébraux à partir de cellules souches pluripotentes induites dans des mini-bioréacteurs faits maison

The iPSC-derived brain organoid is a promising technology for in vitro modeling the pathologies of the nervous system and drug screening. This technology ...

Zygote Microinjection for Creating Gene Cassette Knock-in and Flox Alleles in Mice

CRISPR-Cas technology has enabled the rapid and effortless generation of genetically modified mice. Specifically, mice and point mutant mice are readily produced by electroporation of CRISPR factors (and single-stranded oligo DNA donors) into the zygote. In contrast, gene cassette (&#62;1 kb) knock-in and floxed mice are mainly generated by microinjection of CRISPR factors and double-stranded DNA donors into zygotes. Genome editing technologies have also increased the flexibility of genetically modified mice production. It is now possible to introduce the intended mutations in the target genomic regions in a number of beneficial inbred mouse strains. Our team has produced over 200 gene cassette knock-in mouse lines, and over 110 floxed mouse lines by zygote microinjection of CRISPR-Cas9 following requests from several countries, including Japan. Some of these genome editing used BALB/c, C3H/HeJ, and C57BL/6N inbred strains, however most used C57BL/6J. Unlike the electroporation method, genome editing by zygote microinjection in various inbred strains of mice is not that easy. However, gene cassette knock-in and floxed mice on single inbred genetic backgrounds are as critical as genetic humanized, fluorescent reporter, and conditional knockout mouse models. Therefore, this article presents the protocol for the zygote microinjection of CRISPR factors and double-stranded DNA donors in C57BL/6J mice for generating gene cassette knock-in and floxed mice. This article exclusively focuses on nuclear injection rather than cytoplasmic injection. In addition to zygote microinjection, we outline the timeline for the production process and peripheral techniques such as induction of superovulation and embryo transfer.

The present protocol describes zygote microinjection of CRISPR-Cas9 and donor DNA to efficiently produce gene cassette knock-in and floxed mice.

Micro-injection de zygote pour la création d’allèles knock-in et flox de cassette génique chez la souris

CRISPR-Cas technology has enabled the rapid and effortless generation of genetically modified mice. Specifically, mice and point mutant mice are readily ...