TO e TD sono stati supportati rispettivamente dai numeri di sovvenzione JSPS KAKENHI 19H02970 e 20H02999.

1. Mantenimento delle colonie di laboratorio
<ol><li>Per il mantenimento di popolazioni di wildtype e mutanti, utilizzare un grande contenitore di plastica (460 mm x 360 mm x 170 mm) con cibo di pesce artificiale regolare, acqua in tazze di plastica con un foro di ventilazione sulla parte superiore, una carta piegata per nascondere gli insetti e cotone stratificato per la deposizione delle uova(Figura 2A). Mantenere tutte le colture T. domestica all'interno di incubatori a 37 °C e impostare l'umidità relativa (RH) all'interno di ciascun contenitore sul 60%-80%. NOTA: Poiché T. domestica assorbe il vapore acqueo dall'atmosfera11, non è necessario un approvvigionamento idrico diretto. L'rh appropriato viene mantenuto a causa della presenza di vapore acqueo da tazze di plastica contenenti un foro di ventilazione sulla parte superiore o da tazze senza coperchio all'interno di ogni contenitore. Non è necessario umidificare all'interno di un intero incubatore che contiene colture. La durata approssimativa di ogni fase di sviluppo alle condizioni descritte nel presente protocollo è illustrata nella figura 1. La velocità di sviluppo potrebbe essere regolata modificando la temperatura e/o RH12.</li>
	<li>Aggiungere periodicamente del cibo. Aggiungere acqua prima che si aserti.</li>
	<li>Trasferire le popolazioni in un nuovo contenitore pulito almeno ogni 3 mesi, dato che gli adulti smettono di deporre le uova in un ambiente sporco e/o in una popolazione densa (cfr. discussione).</li>
</ol>2. Raccolta delle uova e microiniezione
<ol><li>Progettare un RNA guida (gRNA)<ol>
<li>Progettare una sequenza di gRNA per ogni bersaglio richiesto e FAR ESPLODERE le sequenze di gRNA rispetto all'assemblaggio del genoma per controllare possibili siti di riconoscimento fuori bersaglio.</li>
		<li>Sintetizzare e purificare i gRNA secondo le istruzioni del produttore8. NOTA: Ad esempio, nel caso del gene bianco del trasportatore di cassette legante ATP, è stata progettata una sequenza target di 20 bp e sono stati ordinati due oligonucleotidi del DNA sintetizzati 5'-TAATACGACTCACTATAGTAAGTGTTGTGGGAC-3' e 5'-TTCTAGCTAAAACATCGGTCCCACAACACTTA-3'. Il modello di DNA è stato preparato ricotturando questi due oligonucleotidi seguiti dall'amplificazione PCR e il gRNA viene quindi trascritto in vitro dal modello con una T7 RNA polimerasi.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparare colonie di raccolta delle uova<ol>
<li>Trasferire circa 20 adulti maschi e 20 femmine in un contenitore di medie dimensioni (200 mm x 150 mm x 90 mm) con cibo, approvvigionamento idrico, una carta piegata e un piccolo pezzo di cotone stratificato per la deposizione delle uova(Figura 2B).</li>
		<li>Creare diverse colonie per ottenere un gran numero di embrioni messi in scena in un breve periodo di tempo da utilizzare per l'editing del genoma. NOTA: Si prevede che circa 20-40 uova saranno raccolte da una colonia dopo 8 ore a 37 °C. Di solito ci vogliono alcuni giorni perché gli adulti trasferiti inizino a deporre le uova, probabilmente a causa dell'adattamento a un nuovo ambiente.</li>
	</ol></li>
	<li>Il giorno dell'iniezione, sostituire il cotone all'interno dei contenitori con quelli nuovi.</li>
	<li>Posizionare un nastro 76 mm x 5 mm su un normale scivolo di vetro da 76 mm x 26 mm.</li>
	<li>Otto ore dopo, raccogli le uova dal cotone stratificato separando gli strati usando le forcep.</li>
	<li>Allineare le uova sul nastro a doppia parte utilizzando un pennello bagnato e mantenere una distanza di 2 mm tra le uova. Tutte le uova devono essere orientate in modo che l'asse longitudinale di un uovo sia fronte al lato dell'iniezione(figura 3A). Premere delicatamente le uova con un pennello per una tenuta ferma durante l'iniezione. NOTA: In questo protocollo, il fungo cresce velocemente nelle uova iniettate danneggiate in condizioni umide e calde. È importante mantenere la distanza tra le uova per prevenire la contaminazione incrociata e l'espansione del fungo.</li>
	<li>Mescolare la proteina gRNA e Cas9 con una concentrazione finale rispettivamente di 100 ng/μL e 500 ng/μL. Utilizzare acqua distillata per la diluizione. Incubare il mix per 10 minuti a temperatura ambiente per promuovere la formazione complessa di ribonucleoproteina e quindi mantenere il mix sul ghiaccio. NOTA: Il rosso neutro a una concentrazione finale dell'1% potrebbe essere aggiunto alla soluzione di iniezione per monitorare la quantità iniettata.</li>
	<li>Caricare 2 μL della soluzione gRNA/Cas9 in un capillare di iniezione di vetro con un microloader. Assicurarsi che non ci siano bolle d'aria nella soluzione prima dell'iniezione. Se necessario, toccare l'ago per rimuovere le bolle. NOTA: In questo esperimento viene utilizzato un ago già pronto per ottenere una punta dell'ago fine (Figura 3B). Un ago fatto in casa con una forma simile potrebbe invece essere usato.</li>
	<li>Fissare il capillare di iniezione di vetro, precedentemente caricato con la soluzione gRNA/Cas9, a un supporto dotato di manipolatore e collegare il supporto a un microiniettore elettronico.</li>
	<li>Ottimizzare la forma della punta dell'ago rompendola leggermente con pini per evitare l'intasamento e ottenere una migliore durata durante una serie di iniezioni (un esempio di ago appropriato è mostrato nella figura 3C). NOTA: Si consiglia di cambiare un ago quando è intasato. È possibile continuare a iniettare con lo stesso ago se viene rotto di nuovo con pini, ma una punta più ampia porta a più danni alle uova e abbassa il loro tasso di sopravvivenza. Poiché le uova T. domestica sono morbide e fragili, mantenere una punta dell'ago fine è la chiave per avere un alto tasso di sopravvivenza dopo l'iniezione.</li>
	<li>Inserire l'ago nel punto centrale dell'asse longitudinale di un uovo e iniettare una leggera quantità della soluzione (vedere figura 3D-H per riferimento sulla quantità di iniezione). Regolare la configurazione del microiniettore elettronico durante l'iniezione, a seconda della forma della punta dell'ago. NOTA: Si consiglia di applicare una pressione costante durante l'iniezione, altrimenti il contenuto di uova appiccicoso può facilmente fluire nell'ago di vetro e può ostruirlo. La soluzione può essere iniettare un impulso di pressione breve o con una pressione costante, a seconda della quantità di liquido iniettato. Tenere presente che quando una punta dell'ago ha un'ampia apertura, inietta troppa soluzione in un uovo, il che causa letalità (Figura 3F-H). In tal caso, mantenere un flusso liquido costante a pressione costante, quindi inserire l'ago in un uovo ed estrarlo immediatamente. Se provoca troppo overflow o l'uovo esplode, cambiare l'ago.</li>
	<li>Conservare le uova iniettate in un contenitore con le dimensioni appropriate per il numero di uova iniettate (<20 uova: piccolo piatto; >20 uova: contenitore di medie dimensioni) con 60%-80% RH e 37 °C.</li>
</ol>3. Accoppiamento
<ol><li>Controllare periodicamente le uova iniettate e scartare le uova danneggiate con forcep per evitare la crescita fungina(Figura 3I,J). Nel caso in cui troppo fungo cresce su un uovo, pulire la superficie dell'uovo con il 70% di EtOH.</li>
	<li>Prima della schiusa (circa 10 giorni a 37 °C dopo la deposizione delle uova), immergere lo scivolo di vetro con le uova iniettate in polvere di talco per rivestire la superficie del nastro a doppia mano. Ciò eviterà l'impilamento di ninfe tratteggiate. Trasferisci i vetri rivestiti di polvere in un contenitore di medie dimensioni con cibo, acqua e una carta piegata per nascondere gli insetti.</li>
	<li>Rimuovere gli scivoli di vetro dopo che le ninfe si sono schiuse. Fornire periodicamente cibo fino a raggiungere l'età adulta. NOTA: Ci vogliono circa 2,0-2,5 mesi perché gli individui raggiungano l'età adulta dopo la schiusa (Figura 1A). Lo stadio adulto è giudicato sulla base di un ovopositore ben sviluppato nelle femmine (Figura 1B).</li>
	<li>Per accoppiare gli individui, trasferire tutte le adulti femmine di tipo selvatico necessarie da una colonia di laboratorio al contenitore di medie dimensioni e incubarle per almeno 14 giorni a 37 °C per assicurarsi che siano vergini. NOTA: Non è necessario raccogliere femmine vergini da una colonia di laboratorio perché l'adulto T. domestica ha un ciclo ripetuto di muta e accoppiamento chiamato "ciclo riproduttivo e muta", durante il quale le femmine gettano via lo sperma con ogni muta e si accoppiano di nuovo nel prossimo ciclo di fecondazione13.</li>
	<li>Trasferire un maschio o una femmina G0 adulto che si è sviluppato da un uovo iniettato e adulto di tipo selvatico a un piccolo piatto di plastica (Ø 100 mm x 40 mm) con cibo, una carta piegata e un piccolo pezzo di cotone per la deposizione delle uova G1(Figura 2C'; piatto di accoppiamento). Conservare i piatti di accoppiamento in un contenitore più grande con 60%-80% RH (Figura 2C). NOTA: Più adulti di tipo selvatico possono essere inclusi in un piatto per aumentare le possibilità di accoppiamento di successo, anche se sono stati raggiunti alti tassi di successo con l'accoppiamento uno a uno.</li>
</ol>4. Genotipizzazione
<ol><li>Progetta coppie di primer PCR per ogni gRNA per amplificare un prodotto da 100 a 200 bp che include il sito preso di mira dal gRNA. BLAST ogni sequenza di primer rispetto all'assemblaggio del genoma per verificarne la specificità (un esempio è mostrato per il targeting del gene bianco nella figura 4A).</li>
	<li>Controlla la trasformazione germinale degli adulti G0.<ol>
<li>Cinque giorni dopo la deposizione delle uova, raccogliere singole uova G1 da ogni coppia adulta G0 in tubi da 0,2 ml (un uovo per tubo; conservare campioni raccolti a -20 °C per una conservazione a lungo termine). Separare gli strati di cotone per raccogliere le uova. NOTA: Si consiglia di genotipare almeno 12 ninfe G1 da ogni coppia di accoppiamenti per valutare il successo della trasmissione della linea germinale (vedi Risultati rappresentativi).</li>
		<li>Aggiungere 15 μL di una soluzione di Proteinasi K da 0,25 mg/mL (sciolta nel tampone Tris-EDTA) a ciascun tubo, omogeneizzare brevemente i campioni con stuzzicadenti e incubare a 55 °C per 3-16 ore.</li>
		<li>Inattivare la Proteinasi K posizionando i campioni a 95 °C per 10 min.</li>
		<li>Aggiungere 90 μL di acqua distillata ad ogni tubo e mescolare bene. Utilizzare 2 μL di supernatante in una miscela di reazione PCR da 10 μL contenente i primer progettati nella fase 4.1. NOTA: Si consiglia l'uso di una DNA polimerasi ottimizzata per i modelli grezzi per raggiungere un'amplificazione PCR sufficiente.</li>
		<li>Per analizzare i prodotti PCR, eseguire un saggio di mobilità eteroduplex (HMA) con un sistema di elettroforesi a microchip(Figura 3B;vedi Ohde et al., 2018)8. NOTA: Le mutazioni potrebbero essere valutate con due metodi alternativi: (1) HMA con polimeri gel standard, come l'8% di poliacrilammide14; (2) digestione di prodotti PCR con endonucleasi T7 seguita da elettroforesi del gel di agarosio15.</li>
		<li>Conservare solo le ninfe G1 risultanti da adulti G0 che contengono mutazioni nella loro linea germinale e scartare le altre.</li>
	</ol></li>
	<li>Genotipizzazione individuale di ninfe/adulti G1<ol>
<li>Isolare le ninfe G1 in piastre da 24 po 'con un aspiratore o un pennello. Posizionare le piastre a 24 pomp poggiamenti in un contenitore più grande (ad esempio, il contenitore di medie dimensioni utilizzato in questo protocollo) con l'approvvigionamento idrico come descritto sopra per mantenere un RH del 60%-80%(Figura 1D). Mantenere l'approvvigionamento di alimenti artificiali regolari a base dipesce (figura 1D'). NOTA: Sebbene questo passaggio possa essere eseguito in qualsiasi punto delle fasi ninfee e adulte, si consiglia di eseguito dopo aver raggiunto l'età adulta e poco prima dell'accoppiamento (>2,5 mesi dopo l'iniezione; Figura 1B) perché è più facile mantenere i vigili del fuoco in un grande contenitore. L'allevamento individuale è necessario per tracciare il genotipo di ogni ninfa G1 nei seguenti passaggi. Le ninfe G1 dello stesso adulto G0 possono avere mutazioni diverse.</li>
		<li>Pizzicare e estrarre i cerci e il filamento caudale da una ninfa/adulto usando le flesse e raccoglierli in un tubo da 0,2 ml contenente 50 μL EtOH (conservare i campioni raccolti a -20 °C per una conservazione a lungo termine). NOTA: I campioni di tessuto vengono raccolti in EtOH perché prevengono la perdita di questi piccoli campioni a causa dell'elettricità statica. Se è necessario fermare il movimento degli insetti, anestetizzare la ninfa / adulto sul ghiaccio quando si preleva campioni di tessuto. Poiché T. domestica non può sopravvivere dopo il raffreddamento a lungo termine sul ghiaccio, non anestetizzarli per più di un minuto e spostarli immediatamente a temperatura ambiente. L'ablazione dei cerci e del filamento caudale non causa alcun aumento della mortalità.</li>
		<li>Posizionare i tubi campione con i coperchi aperti su un blocco termico per 15 minuti a 70 °C per evaporare l'EtOH.</li>
		<li>Ripetere i passaggi da 4.2.2 a 4.2.5 per genotipizzazione.</li>
		<li>Inviare i prodotti PCR in cui si osserva un modello di banda mutante a un servizio di sequenziamento Sanger standard.</li>
		<li>Mantenere le ninfe/adulti G1 con le mutazioni desiderate e scartare le altre (vedere la figura 4C per un risultato di sequenziamento rappresentativo).</li>
	</ol></li>
	<li>Attraversa gli adulti contenenti le mutazioni desiderate in un piatto di accoppiamento e ottieni le generazioni successive per stabilire un ceppo mutante omozigoto.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Peterson, M. D., Rogers, B. T., Popadi&#263;, A., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+expression+pattern+of+labial,+posterior+homeotic+complex+genes+and+the+teashirt+homologue+in+an+apterygote+insect.">The embryonic expression pattern of labial, posterior homeotic complex genes and the teashirt homologue in an apterygote insect.</a> Development Genes and Evolution. 209, 77-90 (1999).</li><li>Farris, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+organization+of+the+mushroom+bodies+of+Thermobia+domestica+(Zygentoma,+Lepismatidae):+Insights+into+mushroom+body+evolution+from+a+basal+insect.">Developmental organization of the mushroom bodies of Thermobia domestica (Zygentoma, Lepismatidae): Insights into mushroom body evolution from a basal insect.</a> Evolution and Development. 7, 150-159 (2005).</li><li>Kamae, Y., Tanaka, F., Tomioka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+and+functional+analysis+of+the+clock+genes,+Clock+and+cycle,+in+the+firebrat+Thermobia+domestica.">Molecular cloning and functional analysis of the clock genes, Clock and cycle, in the firebrat Thermobia domestica.</a> Journal of Insect Physiology. 56, 1291-1299 (2010).</li><li>Ohde, T., Masumoto, M., Yaginuma, T., Niimi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+RNAi+analysis+in+the+firebrat,+Thermobia+domestica:+Distal-less+is+required+to+form+caudal+filament.">Embryonic RNAi analysis in the firebrat, Thermobia domestica: Distal-less is required to form caudal filament.</a> Journal of Insect Biotechnology and Sericology. 105, 99-105 (2009).</li><li>Ohde, T., Yaginuma, T., Niimi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nymphal+RNAi+analysis+reveals+novel+function+of+scalloped+in+antenna,+cercus+and+caudal+filament+formation+in+the+firebrat,+Thermobia+domestica.">Nymphal RNAi analysis reveals novel function of scalloped in antenna, cercus and caudal filament formation in the firebrat, Thermobia domestica.</a> Journal of Insect Biotechnology and Sericology. 108, 101-108 (2012).</li><li>Bell&#233;s, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+Drosophila:+RNAi+in+vivo+and+functional+genomics+in+insects.">Beyond Drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects.</a> Annual Review of Entomology. 55, 111-128 (2010).</li><li>Ohde, T., Takehana, Y., Shiotsuki, T., Niimi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-based+heritable+targeted+mutagenesis+in+Thermobia+domestica:+A+genetic+tool+in+an+apterygote+development+model+of+wing+evolution.">CRISPR/Cas9-based heritable targeted mutagenesis in Thermobia domestica: A genetic tool in an apterygote development model of wing evolution.</a> Arthropod Structure and Development. 47, 362-369 (2018).</li><li>Nji, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+insects:+Applications,+best+practices+and+biosafety+concerns.">CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns.</a> Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).</li><li>Brand, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+the+odorant+receptor+gene+family+in+insects.">The origin of the odorant receptor gene family in insects.</a> eLife. 7, 1-13 (2018).</li><li>Noble-Nesbitt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+balance+in+the+firebrat,+Thermobia+domestica+(Packard).+Exchanges+of+water+with+the+atmosphere.">Water balance in the firebrat, Thermobia domestica (Packard). Exchanges of water with the atmosphere.</a> Journal of Experimental Biology. 50, 745-769 (1969).</li><li>Sweetman, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+ecology+of+the+firebrat,+Thermobia+domestica+(Packard).">Physical ecology of the firebrat, Thermobia domestica (Packard).</a> Ecological Monographs. 8, 285-311 (1938).</li><li>Nijhout, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Insect Hormones. , (1994).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+detection,+quantification+and+enrichment+of+subtle+allelic+alterations.">Efficient detection, quantification and enrichment of subtle allelic alterations.</a> DNA Research. 19, 423-433 (2012).</li><li>Mashal, R. D., Koontz, J., Sklar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+mutations+by+cleavage+of+DNA+heteroduplexes+with+bacteriophage+resolvases.">Detection of mutations by cleavage of DNA heteroduplexes with bacteriophage resolvases.</a> Nature Genetics. 9, 177-183 (1995).</li><li>Adams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+notes+upon+the+firebrat,+Thermobia+domestica+Packard.">Biological notes upon the firebrat, Thermobia domestica Packard.</a> Journal of the New York Entomological Society. 41, 557-562 (1933).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Per la generazione di successo del mutante T. domestica desiderato con CRISPR / Cas9, è prima importante raccogliere un numero sufficiente di embrioni messi in scena per l'iniezione. Per una raccolta costante di un numero sufficiente di uova T. domestica, la chiave è selezionare una dimensione appropriata del contenitore per avere una densità di popolazione inferiore perché aiuterebbe il completamento di una serie di complessi comportamenti di accoppiamento, che viene ripetuto dopo ogni muta adulta<...

Thermobia domestica appartiene a uno degli ordini di insetti più basali, Zygentoma, che conserva un ciclo di vita ancestrale ametabolico e senza ali. Tale posizione filogenetica basale e caratteristiche ancestrali hanno fissato questa specie come un modello attraente per studiare i meccanismi alla base del successo degli insetti sulla Terra, che coprono oltre il 70% della specie animaledescritta 1. T. domestica è stato a lungo utilizzato principalmente per studiare le caratteristiche ancestrali della fisiologia degli insetti a causa delle sue caratteristiche adatte come modello di laboratorio, come un ciclo di vita relativamente breve (2,5-3,0 mesi dall'embrione all'adulto riproduttivo; Figura 1A) e un allevamento facile. Negli ultimi tre decenni, il suo uso è stato ampliato per indagare le caratteristiche ancestrali di vari tratti come la pianta corporea, la differenziazione neurale e i ritmicircadiani 2,3,4.
L'applicazione di strumenti genetici avanzati in T. domestica potrebbe accelerare ulteriormente tali contributi in un'ampia area di ricerca. Il successo dell'interferenza dell'RNA (RNAi) mediato dal gene in embrioni, ninfe e adulti è stato riportato in T. domestica4,5,6. L'efficienza della RNAi sistemica è ancora altamente dipendente dalle specie, ad esempio è generalmente elevata nei coleotteri mentre è bassa nell'ordine dei lepidotteri7. L'efficienza e la durata del knockdown RNAi in T. domestica devono ancora essere valutate. Oltre a RNAi, abbiamo precedentemente segnalato un knockout genico mediato da CRISPR / Cas9 di successo in T. domestica8. Il sistema CRISPR/Cas è stato ampiamente applicato per l'editing del genoma negli insetti, in particolare per il knockout genico mirato. Il suo uso potrebbe essere ampliato per altre applicazioni come il test gene reporter, il tracciamento del lignaggio cellulare e la manipolazione dell'attività trascrizionale bussando a costrutti esogeni dopo l'istituzione di un protocollo per la consegna di componenti del sistema CRISPR / Cas nei nuclei9. In combinazione con l'assemblaggio del genomapubblicato 10, l'ampio utilizzo e l'ulteriore sviluppo dell'editing del genoma basato su CRISPR /Cas in T. domestica faciliterebbero gli studi incentrati sui meccanismi evolutivi alla base dell'eccezionale successo adattivo degli insetti. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per la microiniezione embrionale e per l'accoppiamento di T. domestica adulto per generare un ceppo mutante utilizzando CRISPR / Cas9. Considerando questo nuovo metodo, discutiamo l'importanza di considerare la biologia unica delle specie modello non tradizionali per applicazioni di successo di queste tecniche.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>83-3738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3, 100 &#181;g</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>1081060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-static cleaner</td>
			<td>Hozan</td>
			<td>Z-292</td>
			<td>for removing static electricity from a 24-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barrier Box 20.7L</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>4-5606-01</td>
			<td>Large container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FemtoJet 4i</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5252000013</td>
			<td>Electronic microinjector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtotip II, injection capillary</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242957000</td>
			<td>Glass injection capillary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Pack 2440mL</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>5-068-25</td>
			<td>Middle-sized container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MIR-554-PJ</td>
			<td>for 37 &#176;C incubation. No need to humidify inside the incubator.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOD Fx Neo</td>
			<td>Toyobo</td>
			<td>KFX-101</td>
			<td>PCR enzyme for genotyping. Optimized for an amplification from crude templates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GJ-8</td>
			<td>for holding the micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MM-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX12</td>
			<td>for microinjection. More than 35X magnification is sufficient for the microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiNA</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>MCE-202</td>
			<td>Microchip electrophoresis system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NiceTac</td>
			<td>Nichiban</td>
			<td>NW-5</td>
			<td>Double-sided tape to place eggs on a glass slide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint brush (horse hair)</td>
			<td>Pentel</td>
			<td>ZBS1-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant culture dish</td>
			<td>SPL Life Sciences</td>
			<td>310100</td>
			<td>Mating dish and water supplies for a large and middle-sized containers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K, recombinant, PCR Grade Lyophilizate from Pichia pastoris</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3115836001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SZX 12 microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX 12</td>
			<td>More than 35X magnification is sufficient for the microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talcum powder</td>
			<td>Maruishi</td>
			<td>877113</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetra Goldfish Gold Growth</td>
			<td>Spectrum Brands</td>
			<td></td>
			<td>Artificial regular fish food</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

egg microinjection and efficient mating for genome editing in the firebrat thermobia domestica

Il firebrat Thermobia domestica è una specie ametabolica e senza ali adatta allo studio dei meccanismi di sviluppo degli insetti che hanno portato alla loro riuscita radiazione evolutiva sulla terra. L'applicazione di strumenti genetici come l'editing del genoma è la chiave per comprendere i cambiamenti genetici che sono responsabili delle transizioni evolutive in un approccio Evo-Devo. In questo articolo, descriviamo il nostro attuale protocollo per la generazione e la manutenzione di ceppi mutanti di T. domestica. Riportiamo un metodo di iniezione secca, in alternativa al metodo di iniezione umida riportato, che ci consente di ottenere tassi di sopravvivenza stabilmente elevati negli embrioni iniettati. Reportiamo anche un ambiente ottimizzato per accoppiare gli adulti e ottenere le generazioni successive con alta efficienza. Il nostro metodo sottolinea l'importanza di tenere conto della biologia unica di ciascuna specie per il successo dell'applicazione dei metodi di modifica del genoma agli organismi modello non tradizionali. Prevediamo che questi protocolli di editing del genoma aiuteranno nell'implementazione di T. domestica come modello di laboratorio e accelereranno ulteriormente lo sviluppo e l'applicazione di strumenti genetici utili in questa specie.

Nelle nostre mani, circa 100 uova possono essere ben iniettate con un singolo capillare di iniezione quando ha la punta adeguata(Figura 3C). L'iniezione di gRNA/Cas9 complesso di ribonucleoproteina negli embrioni entro le prime 8 ore dopo la deposizione delle uova provoca indeli nel sito mirato al gRNA. Ciò causa mutazioni bialleliche in alcune cellule della generazione iniettata (G0) e quindi i fenotipi di mosaico mutante sono solitamente ottenuti in G0. Ad esempio, quando questo protocoll...

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Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

Forniamo un protocollo dettagliato per l'allevamento, la microiniezione delle uova e per l'accoppiamento efficiente del firebrat Thermobia domestica per generare e mantenere ceppi mutanti dopo l'editing del genoma.

Microiniezione delle uova e accoppiamento efficiente per l'editing genomico nella Termbia domestica Firebrat

The firebrat Thermobia domestica is an ametabolous, wingless species that is suitable for studying the developmental mechanisms of insects that led to ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

4.3K Views.  Kyoto University. Forniamo un protocollo dettagliato per l'allevamento, la microiniezione delle uova e per l'accoppiamento efficiente del firebrat Thermobia domestica per generare e mantenere ceppi mutanti dopo l'editing del genoma.

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Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Analisi delle larve Zebrafish muscolo scheletrico Integrità con Blu di Evans Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus embryos are large, develop externally, and can be easily manipulated by microinjection or surgical procedures. In addition, fate maps have been established for early Xenopus embryos. Targeted microinjection into the individual blastomere that will eventually give rise to an organ or tissue of interest can be used to selectively overexpress or knock down gene expression within this restricted region, decreasing secondary effects in the rest of the developing embryo. In this protocol, we describe how to utilize established Xenopus fate maps to target the developing Xenopus kidney (the pronephros), through microinjection into specific blastomere of 4- and 8-cell embryos. Injection of lineage tracers allows verification of the specific targeting of the injection. After embryos have developed to stage 38 - 40, whole-mount immunostaining is used to visualize pronephric development, and the contribution by targeted cells to the pronephros can be assessed. The same technique can be adapted to target other tissue types in addition to the pronephros.

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

Tecnica a Target microiniezione per lo sviluppo<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Identification of Critical Conditions for Immunostaining in the Pea Aphid Embryos: Increasing Tissue Permeability and Decreasing Background Staining

The pea aphid Acyrthosiphon pisum, with a sequenced genome and abundant phenotypic plasticity, has become an emerging model for genomic and developmental studies. Like other aphids, A. pisum propagate rapidly via parthenogenetic viviparous reproduction, where the embryos develop within egg chambers in an assembly-line fashion in the ovariole. Previously we have established a robust platform of whole-mount in situ hybridization allowing detection of mRNA expression in the aphid embryos. For analyzing the expression of protein, though, established protocols for immunostaining the ovarioles of asexual viviparous aphids did not produce satisfactory results. Here we report conditions optimized for increasing tissue permeability and decreasing background staining, both of which were problems when applying established approaches. Optimizations include: (1) incubation of proteinase K (1 &#181;g/ml, 10 min), which was found essential for antibody penetration in mid- and late-stage aphid embryos; (2) replacement of normal goat serum/bovine serum albumin with a blocking reagent supplied by a Digoxigenin (DIG)-based buffer set and (3) application of methanol rather hydrogen peroxide (H2O2) for bleaching endogenous peroxidase; which significantly reduced the background staining in the aphid tissues. These critical conditions optimized for immunostaining will allow effective detection of gene products in the embryos of A. pisum and other aphids.

A protocol of whole-mount immunostaining on aphid embryos is presented, in which critical conditions for decreasing background staining and increasing tissue permeability are addressed. These conditions are specifically developed for effective detection of protein expression in the embryonic tissues of aphids.

Individuazione di condizioni critiche per Immunostaining nel pisello afide embrioni: l&#39;aumento del tessuto Permeabilità e diminuire la colorazione di fondo

The pea aphid Acyrthosiphon pisum, with a sequenced genome and abundant phenotypic plasticity, has become an emerging model for genomic and developmental ...

Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and behavioral phenotypes. The remarkably diverse phenotypes that have evolved as marine populations adapt to countless freshwater environments, combined with the ability to cross marine and freshwater forms, provide a rare vertebrate system in which genetics can be used to map genomic regions controlling evolved traits. Excellent genomic resources are now available, facilitating molecular genetic dissection of evolved changes. While mapping experiments generate lists of interesting candidate genes, functional genetic manipulations are required to test the roles of these genes. Gene regulation can be studied with transgenic reporter plasmids and BACs integrated into the genome using the Tol2 transposase system. Functions of specific candidate genes and cis-regulatory elements can be assessed by inducing targeted mutations with TALEN and CRISPR/Cas9 genome editing reagents. All methods require introducing nucleic acids into fertilized one-cell stickleback embryos, a task made challenging by the thick chorion of stickleback embryos and the relatively small and thin blastomere. Here, a detailed protocol for microinjection of nucleic acids into stickleback embryos is described for transgenic and genome editing applications to study gene expression and function, as well as techniques to assess the success of transgenesis and recover stable lines.

Transgenic manipulations and genome editing are critical for functionally testing the roles of genes and cis-regulatory elements. Here a detailed microinjection protocol for the generation of genomic modifications (including Tol2-mediated fluorescent reporter transgene constructs, TALENs, and CRISPRs) is presented for the emergent model fish, the threespine stickleback.

Microiniezione per Transgenesi e Genome Editing in Threespine spinarelli

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance to man of conventional invertebrate model systems and the complexity of genomes in vertebrates are critical challenges to modeling human normal and pathological conditions. The chordate Ciona intestinalis is an invertebrate chordate that emerged from a common ancestor with the vertebrates and may represent features at the interface between invertebrates and vertebrates. A common body plan with much simpler cellular and genomic composition should unveil gene regulatory network (GRN) links and functional genomics readouts explaining phenomena in the vertebrate condition. The compact genome of Ciona, a fixed embryonic lineage with few divisions and large cells, combined with versatile community tools foster efficient gene functional analyses in this organism. Here, we present several crucial methods for this promising model organism, which belongs to the closest sister group to vertebrates. We present protocols for transient transgenesis by electroporation, along with microinjection-mediated gene knockdown, which together provide the means to study gene function and genomic regulatory elements. We extend our protocols to provide information on how community databases are utilized for in silico design of gene regulatory or gene functional experiments. An example study demonstrates how novel information can be gained on the interplay, and its quantification, of selected neural factors conserved between Ciona and man. Furthermore, we show examples of differential subcellular localization in embryonic cells, following DNA electroporation in Ciona zygotes. Finally, we discuss the potential of these protocols to be adapted for tissue specific gene interference with emerging gene editing methods. The in vivo approaches in Ciona overcome major shortcomings of classical model organisms in the quest of unraveling conserved mechanisms in the chordate developmental program, relevant to stem cell research, drug discovery, and subsequent clinical application.

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

We present transient transgenesis and gene knockdown in Ciona intestinalis, a chordate sister group to vertebrates, using microinjection and electroporation techniques. Such methods facilitate functional genomics in this simple invertebrate that features rudimentary characteristics of vertebrates, including notochord and head sensory epithelia, and many orthologs of human disease associated genes.

Embrione microiniezione e elettroporazione in chordate<em&gt; Intestinalis Ciona</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning fundamental developmental biology through to large-scale genetic and chemical screens. However, many experiments, especially those related to infection and xenograft models, rely on microinjection and imaging of embryos and larvae, which are laborious techniques that require skill and expertise. To improve the precision and throughput of current microinjection techniques, we developed a series of microstructured devices to orient and stabilize zebrafish embryos at 2 days post fertilization (dpf) in ventral, dorsal, or lateral orientation prior to the procedure. To aid in the imaging of embryos, we also designed a simple device with channels that orient 4 zebrafish laterally in parallel against a glass cover slip. Together, the tools that we present here demonstrate the effectiveness of photolithographic approaches to generate useful devices for the optimization of zebrafish techniques.

Microinjection of zebrafish embryos and larvae is a crucial but challenging technique used in many zebrafish models. Here, we present a range of microscale tools to aid in the stabilization and orientation of zebrafish for both microinjection and imaging.

Dispositivi microstrutturati Microinjection ottimizzata e Imaging delle larve di Zebrafish

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning ...

Collection of Post-mating Semen from the Female Reproductive Tract and Measurement of Semen Liquefaction in Mice

In mice, ejaculated semen is deposited in the uterus. After ejaculation, the semen changes consistency from gel-like to watery, a process called liquefaction. In this study, we show how to collect the post-ejaculated semen from the female reproductive tract in a mouse model. First, adult female mice in the estrus stage were housed in a male&#39;s cage overnight. The next morning, copulation was confirmed by the presence of copulatory plug at the vaginal opening. Female mice with copulatory plugs were euthanized, and each reproductive tract was collected as a whole (vagina, uterus, oviducts, ovaries), ensuring a closed system to contain the semen. The reproductive tract was placed in a 1.5 mL microcentrifuge tube, and the vagina was cut off to release the semen into the tube. To ensure maximum semen volume for analysis, toothless forceps were used to squeeze the uterine horns from ovarian end to vaginal end expelling remaining semen. The whole reproductive tract was then discarded. The semen-containing tube was briefly spun down. A 25 &#956;L capillary pipette was placed into the tube at a 180&#176; angle (parallel to the tube wall). The amount of time used to fill the capillary tube to the 25 &#956;L line was recorded. Semen from a proven male breeder usually takes approximately 60-180 s to fill a 25 &#956;L capillary tube. This semen collection technique can also be used in other downstream applications such as sperm imaging and motility analysis.

Semen liquefaction is required for sperm to be liberated from the seminal gel. This study provides the procedures for collecting semen from the female reproductive tract post-coitus, and measuring semen liquefaction time.

Raccolta di post-accoppiamento sperma dal tratto riproduttivo femminile e la misurazione della liquefazione dello sperma nei topi

In mice, ejaculated semen is deposited in the uterus. After ejaculation, the semen changes consistency from gel-like to watery, a process called ...

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of cells or tissues in model organisms. These systems contain two components as separate transgenic lines. A driver line expresses a transcriptional activator under the control of tissue-specific promoters/enhancers, and a reporter/effector line harbors a target gene placed downstream to the binding site of the transcription activator. Animals harboring both components induce tissue-specific transactivation of a target gene expression. Precise spatiotemporal expression of the gene in targeted tissues is critical for unbiased interpretation of cell/gene activity. Therefore, developing a method for generating exclusive cell/tissue-specific driver lines is essential. Here we present a method to generate highly tissue-specific targeted expression system by employing a &#34;Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat/CRISPR-associated&#34; (CRISPR/Cas)-based genome editing technique. In this method, the endonuclease Cas9 is targeted by two chimeric guide RNAs (gRNA) to specific sites in the first coding exon of a gene in the Drosophila genome to create double-strand breaks (DSB). Subsequently, using an exogenous donor plasmid containing the transactivator sequence, the cell-autonomous repair machinery enables homology-directed repair (HDR) of the DSB, resulting in precise deletion and replacement of the exon with the transactivator sequence. The knocked-in transactivator is expressed exclusively in cells where the cis-regulatory elements of the replaced gene are functional. The detailed step-by-step protocol presented here for generating a binary transcriptional driver expressed in Drosophila fgf/branchless-producing epithelial/neuronal cells can be adopted for any gene- or tissue-specific expression.

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

Here, we present a method for generating tissue-specific binary transcription systems in Drosophila by replacing the first coding exon of genes with transcription drivers. The CRISPR/Cas9-based method places a transactivator sequence under the endogenous regulation of a replaced gene, and consequently facilitates transctivator expression exclusively in gene-specific spatiotemporal patterns.

Una strategia efficace per la generazione di sistemi di trascrizione binario tessuto-specifici in Drosophila genoma modificando

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a general challenge in developmental biology research. In the embryonic heart, this can be particularly difficult as regional differences in the expression of transcriptional regulators, paracrine/juxtacrine signaling cues, and hemodynamic force are all known to influence cardiomyocyte maturation. A simplified method to alter a developing cardiomyocyte's molecular and biomechanical microenvironment would, therefore, serve as a powerful technique to examine how local conditions influence cell fate and function. To address this, we have optimized a method to physically transplant juvenile cardiomyocytes into ectopic locations in the heart or the surrounding embryonic tissue. This allows us to examine how microenvironmental conditions influence cardiomyocyte fate transitions at single cell resolution within the intact embryo. Here, we describe a protocol in which embryonic myocytes can be isolated from a variety of cardiac sub-domains, dissociated, fluorescently labeled, and microinjected into host embryos with high precision. Cells can then be directly analyzed in situ using a variety of imaging and histological techniques. This protocol is a powerful alternative to traditional grafting experiments that can be prohibitively difficult in a moving tissue such as the heart. The general outline of this method can also be adapted to a variety of donor tissues and host environments, and its ease of use, low cost, and speed make it a potentially useful application for a variety of developmental studies.

In this method, embryonic cardiac tissues are surgically microdissected, dissociated, fluorescently labeled, and implanted into host embryonic tissues. This provides a platform for studying the individual or tissue level developmental organization under ectopic hemodynamic conditions, and/or altered paracrine/juxtacrine environments.

Sistema basato su microiniezione per In Vivo l'impianto di cardiomiociti embrionali nell'embrione aviaria

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Brain Organoid Generation from Induced Pluripotent Stem Cells in Home-Made Mini Bioreactors

The iPSC-derived brain organoid is a promising technology for in vitro modeling the pathologies of the nervous system and drug screening. This technology has emerged recently. It is still in its infancy and has some limitations unsolved yet. The current protocols do not allow obtaining organoids to be consistent enough for drug discovery and preclinical studies. The maturation of organoids can take up to a year, pushing the researchers to launch multiple differentiation processes simultaneously. It imposes additional costs for the laboratory in terms of space and equipment. In addition, brain organoids often have a necrotic zone in the center, which suffers from nutrient and oxygen deficiency. Hence, most current protocols use a circulating system for culture medium to improve nutrition.
Meanwhile, there are no inexpensive dynamic systems or bioreactors for organoid cultivation. This paper describes a protocol for producing brain organoids in compact and inexpensive home-made mini bioreactors. This protocol allows obtaining high quality organoids in large quantities.

Here we describe a protocol for generating brain organoids from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). To obtain brain organoids in large quantities and of high quality, we use home-made mini bioreactors.

Generazione di organoidi cerebrali da cellule staminali pluripotenti indotte in mini bioreattori fatti in casa

The iPSC-derived brain organoid is a promising technology for in vitro modeling the pathologies of the nervous system and drug screening. This technology ...