TO und TD wurden von den JSPS KAKENHI-Zuschussnummern 19H02970 bzw. 20H02999 unterstützt.

1. Pflege von Laborkolonien
<ol><li>Für die Erhaltung von Wildtyp- und Mutantenpopulationen verwenden Sie einen großen Kunststoffbehälter (460 mm x 360 mm x 170 mm) mit regelmäßiger künstlicher Fischnahrung, Wasser in Plastikbechern mit einem Lüftungsloch auf der Oberseite, ein gefaltetes Papier zum Verstecken der Insekten und geschichtete Baumwolle zum Eierlegen(Abbildung 2A). Halten Sie alle T. domestica Kulturen in 37 °C Inkubatoren und stellen Sie die relative Luftfeuchtigkeit (RH) in jedem Behälter auf 60%–80%. HINWEIS: Da T. domestica Wasserdampf aus der Atmosphäre11absorbiert, ist eine direkte Wasserversorgung nicht erforderlich. Der entsprechende RH wird durch das Vorhandensein von Wasserdampf aus Kunststoffbechern, die ein Lüftungsloch auf der Oberseite oder von lidlosen Bechern in jedem Behälter enthalten, aufrechterhalten. Es besteht keine Notwendigkeit, in einem ganzen Brutkasten zu befeuchten, der Kulturen enthält. Die ungefähre Dauer jeder Entwicklungsphase unter der in diesem Protokoll beschriebenen Bedingung ist in Abbildung 1dargestellt. Die Entwicklungsgeschwindigkeit könnte durch Änderung der Temperatur und/oder RH12eingestellt werden.</li>
	<li>Fügen Sie Regelmäßig Lebensmittel hinzu. Fügen Sie Wasser hinzu, bevor es austrocknet.</li>
	<li>Übertragen Sie die Populationen mindestens alle drei Monate in einen neuen sauberen Behälter, da Erwachsene aufhören, Eier in einer schmutzigen Umgebung und/oder einer dichten Bevölkerung zu legen (siehe Diskussion).</li>
</ol>2. Eiersammlung und Mikroinjektion
<ol><li>Entwerfen einer Führungs-RNA (gRNA)<ol>
<li>Entwerfen Sie eine gRNA-Sequenz für jedes benötigte Ziel und BLAST die gRNA-Sequenzen gegen die Genombaugruppe, um mögliche Off-Target-Erkennungsstellen zu überprüfen.</li>
		<li>Synthesisieren und reinigen Sie die gRNAs gemäß den Anweisungen des Herstellers8. HINWEIS: Im Falle eines Targetings des weißen AtP-bindenden Kassettentransporters wurde beispielsweise eine Zielsequenz von 20 bp entwickelt und zwei synthetisierte DNA-Oligonukleotide 5'-TAATACGACTCACTATAGTAAGTGTGTGTGGGAC-3' und 5'-TTCTAGCTCTAAAAACATCGGTCCCACAACACTTA-3' bestellt. Die DNA-Vorlage wurde durch Glühen dieser beiden Oligonukleotide, gefolgt von PCR-Amplifikation, hergestellt und die gRNA wird dann in vitro aus der Schablone mit einer T7-RNA-Polymerase transkribiert.</li>
	</ol></li>
	<li>Vorbereiten von Eiersammelkolonien<ol>
<li>Überführen Sie etwa 20 männliche und 20 weibliche Erwachsene in einen mittelgroßen Behälter (200 mm x 150 mm x 90 mm) mit Nahrung, Wasserversorgung, gefaltetem Papier und einem kleinen Stück geschichteter Baumwolle für die Eiablage(Abbildung 2B).</li>
		<li>Richten Sie mehrere Kolonien ein, um eine große Anzahl von inszenierten Embryonen in kurzer Zeit zu erhalten, um für die Genombearbeitung verwendet zu werden. HINWEIS: Es wird erwartet, dass nach 8 h bei 37 °C etwa 20 bis 40 Eier aus einer Kolonie gesammelt werden. Es dauert in der Regel ein paar Tage für übertragene Erwachsene, um Eier zu legen, möglicherweise aufgrund der Anpassung an eine neue Umgebung.</li>
	</ol></li>
	<li>Ersetzen Sie am Tag der Injektion die Baumwolle in den Behältern durch neue.</li>
	<li>Legen Sie ein 76 mm x 5 mm doppelseitiges Klebeband auf einen normalen 76 mm x 26 mm Glasschlitten.</li>
	<li>Acht Stunden später sammeln Sie die Eier aus der geschichteten Baumwolle, indem Sie die Schichten mit Zangen trennen.</li>
	<li>Richten Sie die Eier auf dem doppelseitigen Klebeband mit einem nassen Pinsel aus und halten Sie einen Abstand von 2 mm zwischen den Eiern. Alle Eier sollten so ausgerichtet sein, dass die Längsachse eines Eis der Injektionsseite gegenübersteht (Abbildung 3A). Drücken Sie die Eier vorsichtig mit einem Pinsel für festes Halten während der Injektion. HINWEIS: In diesem Protokoll wächst Pilz schnell in beschädigten injizierten Eiern unter nassem und warmem Zustand. Es ist wichtig, den Abstand zwischen den Eiern zu halten, um Kreuzkontamination und Ausdehnung des Pilzes zu verhindern.</li>
	<li>Mischen Sie das gRNA- und Cas9-Protein auf eine Endkonzentration von 100 ng/l bzw. 500 ng/l. Verwenden Sie destilliertes Wasser zur Verdünnung. Inkubieren Sie die Mischung für 10 min bei Raumtemperatur, um Ribonukleoprotein-Komplexbildung zu fördern und dann die Mischung auf Eis zu halten. HINWEIS: Neutrales Rot in einer Endkonzentration von 1% könnte der Injektionslösung hinzugefügt werden, um die injizierte Menge zu überwachen.</li>
	<li>Mit einem Mikrolader 2 l der gRNA/Cas9-Lösung in eine Glasinjektionskapillare einzuladen. Stellen Sie sicher, dass sich vor der Injektion keine Luftblasen in der Lösung befinden. Tippen Sie bei Bedarf auf die Nadel, um die Blasen zu entfernen. HINWEIS: In diesem Experiment wird eine fertige Nadel verwendet, um eine feine Nadelspitze zu erhalten (Abbildung 3B). Stattdessen könnte eine selbstgemachte Nadel mit ähnlicher Form verwendet werden.</li>
	<li>Befestigen Sie die Glasinjektionskapillare, die zuvor mit der gRNA/Cas9-Lösung beladen war, an einem mit einem Manipulator ausgestatteten Halter fest und schließen Sie den Halter an einen elektronischen Mikroinjektor an.</li>
	<li>Optimieren Sie die Form der Nadelspitze, indem Sie sie leicht mit Zangen brechen, um Verstopfung zu verhindern und eine bessere Haltbarkeit während einer Reihe von Injektionen zu erhalten (ein Beispiel für eine geeignete Nadel ist in Abbildung 3Cdargestellt). HINWEIS: Es wird empfohlen, eine Nadel zu wechseln, wenn sie verstopft ist. Es ist möglich, weiterhin mit der gleichen Nadel zu injizieren, wenn es wieder mit Zange gebrochen wird, aber eine breitere Spitze führt zu mehr Eischaden und senkt ihre Überlebensrate. Da T. domestica Eier weich und zerbrechlich sind, ist das Halten einer feinen Nadelspitze der Schlüssel für eine hohe Überlebensrate nach der Injektion.</li>
	<li>Setzen Sie die Nadel an der Mitte der Längsachse eines Eis ein und injizieren Sie eine leichte Menge der Lösung (siehe Abbildung 3D-H zur Angabe der Injektionsmenge). Passen Sie die Konfiguration des elektronischen Mikroinjektors während der Injektion an, abhängig von der Form der Nadelspitze. HINWEIS: Es wird empfohlen, während der Injektion einen konstanten Druck aufzutragen, da sonst klebrige Eiinhalte leicht in die Glasnadel fließen und sie verstopfen können. Die Lösung kann sein, entweder mit einem kurzen Druckimpuls oder mit einem konstanten Druck zu injizieren, abhängig von der Menge der injizierten Flüssigkeit. Denken Sie daran, dass, wenn eine Nadelspitze eine breite Öffnung hat, zu viel Lösung in ein Ei injiziert wird, was tödlich enden(Abbildung 3F-H). In diesem Fall einen konstanten Flüssigkeitsfluss durch konstanten Druck aufrecht erhalten, dann die Nadel in ein Ei einsetzen und sofort herausziehen. Wenn es zu viel Überlauf verursacht oder das Ei platzt, ändern Sie die Nadel.</li>
	<li>Bewahren Sie die injizierten Eier in einem Behälter mit der entsprechenden Größe für die Anzahl der injizierten Eier (<20 Eier: kleine Schale; >20 Eier: mittelgroße Behälter) mit 60%–80% RH und 37 °C auf.</li>
</ol>3. Paarung
<ol><li>Überprüfen Sie die injizierten Eier regelmäßig und entsorgen Sie beschädigte Eier mit Zangen, um Pilzwachstum zu vermeiden (Abbildung 3I,J). Falls zu viel Pilz auf einem Ei wächst, reinigen Sie die Oberfläche des Eis mit 70% EtOH.</li>
	<li>Vor dem Schlüpfen (ca. 10 Tage bei 37 °C nach Eiablage) die Glasrutsche mit den injizierten Eiern in Talkumpulver tauchen, um die Oberfläche des doppelseitigen Bandes zu beschichten. Dies wird das Stapeln von geschlüpften Nymphen vermeiden. Übertragen Sie die pulverbeschichteten Glasrutschen in einen mittelgroßen Behälter mit Nahrung, Wasser und einem gefalteten Papier zum Verstecken der Insekten.</li>
	<li>Entfernen Sie die Glasgleitet, nachdem die Nymphen geschlüpft sind. Liefern Sie regelmäßig Nahrung, bis sie das Erwachsenenalter erreichen. HINWEIS: Es dauert etwa 2,0–2,5 Monate, bis Personen nach dem Schlüpfen das Erwachsenenalter erreichen (Abbildung 1A). Die Erwachsenenstufe wird anhand eines gut entwickelten Eileiters bei Frauen beurteilt (Abbildung 1B).</li>
	<li>Um die Individuen zu paaren, übertragen Sie so viele wie nötig wilde weibliche Erwachsene aus einer Laborkolonie in den mittelgroßen Behälter und bebrüten sie für mindestens 14 Tage bei 37 °C, um sicherzustellen, dass sie jungfräulich sind. HINWEIS: Es ist nicht notwendig, jungfräuliche Weibchen aus einer Laborkolonie zu sammeln, weil erwachsene T. domestica einen wiederholten Zyklus von Molting und Paarung namens "Reproduktiv- und Molting-Zyklus", während der Weibchen werfen Weg Sperma mit jedem Molt und mate wieder in den nächsten Befruchtungszyklus13.</li>
	<li>Übertragen Sie entweder einen männlichen oder einen weiblichen G0-Erwachsenen, der sich aus einem injizierten Ei und Wildtyp-Erwachsenen entwickelt hat, auf eine kleine Plastikschale (ca. 100 mm x 40 mm) mit Nahrung, einem gefalteten Papier und einem kleinen Stück Baumwolle zum Legen von G1-Eiern(Abbildung 2C'; Paarungsschale). Bewahren Sie die Paarungsgerichte in einem größeren Behälter mit 60%–80% RH auf (Abbildung 2C). HINWEIS: Mehrere Wildtyp-Erwachsene können in ein Gericht aufgenommen werden, um die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Paarung zu erhöhen, obwohl hohe Erfolgsraten mit eins-zu-eins-Paarung erreicht wurden.</li>
</ol>4. Genotypisierung
<ol><li>Entwerfen Sie PCR-Primerpaare für jede gRNA, um ein 100–200 bp Produkt zu verstärken, das die von der gRNA angestrebte Site enthält. BLAST jede Primersequenz gegen die Genombaugruppe, um ihre Spezifität zu überprüfen (ein Beispiel für die Ausrichtung des weißen Gens in Abbildung 4A).</li>
	<li>Überprüfen Sie die Keimbahntransformation von G0-Erwachsenen.<ol>
<li>Fünf Tage nach dem Legen der Eier einzelne G1-Eier von jedem G0-Erwachsenenpaar in 0,2 ml-Röhrchen (ein Ei pro Tube; gesammelte Proben bei -20 °C für eine Langzeitlagerung lagern). Trennen Sie die Baumwollschichten, um die Eier zu sammeln. HINWEIS: Es wird empfohlen, mindestens 12 G1-Nymphen aus jedem Paar zu genotypisieren, um den Erfolg der Keimbahnübertragung zu bewerten (siehe Repräsentative Ergebnisse).</li>
		<li>Fügen Sie jeder Tube 15 l einer 0,25 mg/ml Proteinase-K-Lösung (gelöst in Tris-EDTA-Puffer) hinzu, homogenisieren Sie Proben kurz mit Zahnstochern und inkubieren Sie bei 55 °C für 3 bis 16 h.</li>
		<li>Inaktivieren Sie die Proteinase K, indem Sie die Proben 10 min bei 95 °C platzieren.</li>
		<li>Fügen Sie 90 l destilliertes Wasser in jedes Rohr und mischen Sie gut. Verwenden Sie 2 l Überstand in einem 10-L-PCR-Reaktionsmix, der die in Schritt 4.1 entworfenen Primer enthält. HINWEIS: Die Verwendung einer DNA-Polymerase, die für rohe Schablonen optimiert ist, wird empfohlen, um eine ausreichende PCR-Verstärkung zu erreichen.</li>
		<li>Um die PCR-Produkte zu analysieren, führen Sie einen Heteroduplex Mobility Assay (HMA) mit einem Mikrochip-Elektrophorese-System durch (Abbildung 3B; siehe Ohde et al., 2018)8. ANMERKUNG: Mutationen könnten mit zwei alternativen Methoden bewertet werden: (1) HMA mit Standard-Gelpolymeren, wie z. B. 8% Polyacrylamid14; (2) Vergärung von PCR-Produkten mit T7-Endonuklease, gefolgt von Agarose-Gel-Elektrophorese15.</li>
		<li>Bewahren Sie nur die G1-Nymphen auf, die von G0-Erwachsenen stammen, die Mutationen in ihrer Keimbahn enthalten, und entsorgen Sie die anderen.</li>
	</ol></li>
	<li>Individuelle Genotypisierung von G1-Nymphen/Erwachsenen<ol>
<li>Isolieren Sie G1-Nymphen in 24-Well-Platten mit einem Aspirator oder einem Pinsel. Legen Sie die 24-Well-Platten in einen größeren Behälter (z. B. den in diesem Protokoll verwendeten mittelgroßen Behälter) mit Wasserversorgung, wie oben beschrieben, um einen RH von 60 % bis 80 % zu halten(Abbildung 1D). Die Versorgung mit künstlichen regelmäßigen Fischfuttern aufrechtzuerhalten(Abbildung 1D'). HINWEIS: Obwohl dieser Schritt an jedem Punkt der Nymphen- und Erwachsenenstadien durchgeführt werden kann, wird empfohlen, ihn nach Erreichen des Erwachsenenalters und kurz vor der Paarung durchzuführen (>2,5 Monate nach der Injektion; Abbildung 1B) weil es einfacher ist, Feuerratten in einem großen Behälter zu warten. Die individuelle Aufzucht ist erforderlich, um den Genotyp jeder G1-Nymphe auf den folgenden Schritten zu verfolgen. G1 Nymphen aus dem gleichen G0-Erwachsenen können unterschiedliche Mutationen haben.</li>
		<li>Cerci und das kaudale Filament einer Nymphe/Erwachsenen mit Zangen kneifen und ziehen und in ein 0,2 ml-Rohr mit 50 L EtOH einsammeln (die gesammelten Proben bei -20 °C für eine Langzeitlagerung lagern). HINWEIS: Gewebeproben werden in EtOH gesammelt, da es den Verlust dieser kleinen Proben durch statische Elektrizität verhindert. Wenn man die Bewegung von Insekten stoppen muss, befeuchten Nymphe/Erwachsener auf Eis, wenn man Gewebeproben nimmt. Da T. domestica nach einer langzeitigen Abkühlung auf Eis nicht überleben kann, befeuchten Sie sie nicht länger als eine Minute und bringen Sie sie sofort wieder auf Raumtemperatur. Die Ablation von Cerci und dem kaudalen Filament führt nicht zu einer Erhöhung der Sterblichkeit.</li>
		<li>Probenrohre mit geöffneten Deckeln auf einem Thermoblock 15 min bei 70 °C aufstellen, um den EtOH zu verdampfen.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 4.2.2–4.2.5 für die Genotypisierung.</li>
		<li>Übermitteln Sie die PCR-Produkte, bei denen ein mutiertes Bandmuster beobachtet wird, an einen Standardmäßigen Sanger-Sequenzierungsdienst.</li>
		<li>Halten Sie die G1 Nymphen/Erwachsenen mit den gewünschten Mutationen und verwerfen Sie die anderen (siehe Abbildung 4C für ein repräsentatives Sequenzierungsergebnis).</li>
	</ol></li>
	<li>Überqueren Sie die Erwachsenen, die die gewünschten Mutationen in einer Paarungsschale enthalten, und erhalten Sie die nächsten Generationen, um einen homozygoten mutierten Stamm zu etablieren.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Peterson, M. D., Rogers, B. T., Popadi&#263;, A., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+expression+pattern+of+labial,+posterior+homeotic+complex+genes+and+the+teashirt+homologue+in+an+apterygote+insect.">The embryonic expression pattern of labial, posterior homeotic complex genes and the teashirt homologue in an apterygote insect.</a> Development Genes and Evolution. 209, 77-90 (1999).</li><li>Farris, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+organization+of+the+mushroom+bodies+of+Thermobia+domestica+(Zygentoma,+Lepismatidae):+Insights+into+mushroom+body+evolution+from+a+basal+insect.">Developmental organization of the mushroom bodies of Thermobia domestica (Zygentoma, Lepismatidae): Insights into mushroom body evolution from a basal insect.</a> Evolution and Development. 7, 150-159 (2005).</li><li>Kamae, Y., Tanaka, F., Tomioka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+and+functional+analysis+of+the+clock+genes,+Clock+and+cycle,+in+the+firebrat+Thermobia+domestica.">Molecular cloning and functional analysis of the clock genes, Clock and cycle, in the firebrat Thermobia domestica.</a> Journal of Insect Physiology. 56, 1291-1299 (2010).</li><li>Ohde, T., Masumoto, M., Yaginuma, T., Niimi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+RNAi+analysis+in+the+firebrat,+Thermobia+domestica:+Distal-less+is+required+to+form+caudal+filament.">Embryonic RNAi analysis in the firebrat, Thermobia domestica: Distal-less is required to form caudal filament.</a> Journal of Insect Biotechnology and Sericology. 105, 99-105 (2009).</li><li>Ohde, T., Yaginuma, T., Niimi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nymphal+RNAi+analysis+reveals+novel+function+of+scalloped+in+antenna,+cercus+and+caudal+filament+formation+in+the+firebrat,+Thermobia+domestica.">Nymphal RNAi analysis reveals novel function of scalloped in antenna, cercus and caudal filament formation in the firebrat, Thermobia domestica.</a> Journal of Insect Biotechnology and Sericology. 108, 101-108 (2012).</li><li>Bell&#233;s, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+Drosophila:+RNAi+in+vivo+and+functional+genomics+in+insects.">Beyond Drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects.</a> Annual Review of Entomology. 55, 111-128 (2010).</li><li>Ohde, T., Takehana, Y., Shiotsuki, T., Niimi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-based+heritable+targeted+mutagenesis+in+Thermobia+domestica:+A+genetic+tool+in+an+apterygote+development+model+of+wing+evolution.">CRISPR/Cas9-based heritable targeted mutagenesis in Thermobia domestica: A genetic tool in an apterygote development model of wing evolution.</a> Arthropod Structure and Development. 47, 362-369 (2018).</li><li>Nji, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+insects:+Applications,+best+practices+and+biosafety+concerns.">CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns.</a> Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).</li><li>Brand, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+the+odorant+receptor+gene+family+in+insects.">The origin of the odorant receptor gene family in insects.</a> eLife. 7, 1-13 (2018).</li><li>Noble-Nesbitt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+balance+in+the+firebrat,+Thermobia+domestica+(Packard).+Exchanges+of+water+with+the+atmosphere.">Water balance in the firebrat, Thermobia domestica (Packard). Exchanges of water with the atmosphere.</a> Journal of Experimental Biology. 50, 745-769 (1969).</li><li>Sweetman, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+ecology+of+the+firebrat,+Thermobia+domestica+(Packard).">Physical ecology of the firebrat, Thermobia domestica (Packard).</a> Ecological Monographs. 8, 285-311 (1938).</li><li>Nijhout, H. 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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Für die erfolgreiche Erzeugung der gewünschten T. domestica Mutante mit CRISPR/Cas9 ist es zunächst wichtig, eine ausreichende Anzahl von inszenierten Embryonen zur Injektion zu sammeln. Für eine konstante Sammlung einer ausreichenden Anzahl von T. domestica Eiern ist der Schlüssel, eine geeignete Größe des Behälters zu wählen, um eine geringere Bevölkerungsdichte zu haben, da es zum erfolgreichen Abschluss einer Reihe von komplexen Paarungsverhalten beitragen würde, die nach jedem Erwachsene...

Thermobia domestica gehört zu einem der basalsten Insektenorden, Zygentoma, das einen uralten ametabolen und flügellosen Lebenszyklus behält. Eine solche basale phylogenetische Position und Ahneneigenschaften setzen diese Art als ein attraktives Modell für die Untersuchung der Mechanismen, die dem Erfolg von Insekten auf der Erde zugrunde liegen, die über 70% der beschriebenen Tierarten abdecken1. T. domestica wird seit langem hauptsächlich zur Untersuchung der Urmerkmale der Insektenphysiologie verwendet, da sie als Labormodell geeignet ist, wie z. B. einen relativ kurzen Lebenszyklus (2,5–3,0 Monate vom Embryo bis zum reproduktiven Erwachsenen; Abbildung 1A) und eine einfache Zucht. In den letzten drei Jahrzehnten wurde seine Verwendung erweitert, um ahnende Eigenschaften verschiedener Merkmale wie Körperplan, neuronale Differenzierung und zirkadiane Rhythmen2,3,4zu untersuchen.
Die Anwendung fortschrittlicher genetischer Werkzeuge in T. domestica könnte solche Beiträge in einem weiten Forschungsgebiet weiter beschleunigen. Erfolgreiche RNA-Interferenz (RNAi)-vermittelter Gen-Knockdown bei Embryonen, Nymphen und Erwachsenen wurde in T. domestica4,5,6berichtet. Die Effizienz von systemischen RNAi ist immer noch stark artenabhängig – zum Beispiel ist sie in coleoptera im Allgemeinen hoch, während sie in der Lepidoptera-Ordnung7niedrig ist. Die Effizienz und Dauer des RNAi-Knockdowns in T. domestica muss noch bewertet werden. Zusätzlich zu RNAi haben wir bereits über einen erfolgreichen CRISPR/Cas9-vermittelten Genknockout in T. domestica8berichtet. Das CRISPR/Cas-System wurde häufig für die Genombearbeitung bei Insekten eingesetzt, insbesondere für gezielte Genknockouts. Seine Verwendung könnte für andere Anwendungen wie Genreporter-Assay, Zelllinienverfolgung und Manipulation der Transkriptionsaktivität erweitert werden, indem exogene Konstrukte nach der Einrichtung eines Protokolls zur Bereitstellung von Komponenten des CRISPR/Cas-Systems in Kerne9eingeschlagen werden. In Kombination mit der veröffentlichten Genombaugruppe10würde die breite Nutzung und Weiterentwicklung der CRISPR/Cas-basierten Genombearbeitung in T. domestica Studien erleichtern, die sich auf die evolutionären Mechanismen hinter dem herausragenden adaptiven Erfolg von Insekten konzentrieren. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Embryo-Mikroinjektion und für die Paarung von Adult T. domestica, um einen mutierten Stamm mit CRISPR/Cas9 zu erzeugen. Unter Berücksichtigung dieser neuartigen Methode diskutieren wir, wie wichtig es ist, die einzigartige Biologie nicht-traditioneller Modellarten für erfolgreiche Anwendungen dieser Techniken zu berücksichtigen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>83-3738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3, 100 &#181;g</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>1081060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-static cleaner</td>
			<td>Hozan</td>
			<td>Z-292</td>
			<td>for removing static electricity from a 24-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barrier Box 20.7L</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>4-5606-01</td>
			<td>Large container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FemtoJet 4i</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5252000013</td>
			<td>Electronic microinjector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtotip II, injection capillary</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242957000</td>
			<td>Glass injection capillary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Pack 2440mL</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>5-068-25</td>
			<td>Middle-sized container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MIR-554-PJ</td>
			<td>for 37 &#176;C incubation. No need to humidify inside the incubator.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOD Fx Neo</td>
			<td>Toyobo</td>
			<td>KFX-101</td>
			<td>PCR enzyme for genotyping. Optimized for an amplification from crude templates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GJ-8</td>
			<td>for holding the micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MM-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX12</td>
			<td>for microinjection. More than 35X magnification is sufficient for the microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiNA</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>MCE-202</td>
			<td>Microchip electrophoresis system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NiceTac</td>
			<td>Nichiban</td>
			<td>NW-5</td>
			<td>Double-sided tape to place eggs on a glass slide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint brush (horse hair)</td>
			<td>Pentel</td>
			<td>ZBS1-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant culture dish</td>
			<td>SPL Life Sciences</td>
			<td>310100</td>
			<td>Mating dish and water supplies for a large and middle-sized containers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K, recombinant, PCR Grade Lyophilizate from Pichia pastoris</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3115836001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SZX 12 microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX 12</td>
			<td>More than 35X magnification is sufficient for the microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talcum powder</td>
			<td>Maruishi</td>
			<td>877113</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetra Goldfish Gold Growth</td>
			<td>Spectrum Brands</td>
			<td></td>
			<td>Artificial regular fish food</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

egg microinjection and efficient mating for genome editing in the firebrat thermobia domestica

Der Feuerbrat Thermobia domestica ist eine ametabolöse, flügellose Art, die sich für die Untersuchung der Entwicklungsmechanismen von Insekten eignet, die zu ihrer erfolgreichen evolutionären Strahlung auf der Erde geführt haben. Die Anwendung genetischer Werkzeuge wie der Genombearbeitung ist der Schlüssel zum Verständnis genetischer Veränderungen, die für evolutionäre Übergänge in einem Evo-Devo-Ansatz verantwortlich sind. In diesem Artikel beschreiben wir unser aktuelles Protokoll zur Erzeugung und Aufrechterhaltung mutierter Stämme von T. domestica. Wir berichten von einer Trockeninjektionsmethode als Alternative zur gemeldeten Nassinjektionsmethode, die es uns ermöglicht, stabil hohe Überlebensraten bei injizierten Embryonen zu erhalten. Wir berichten auch über eine optimierte Umgebungseinstellung, um Erwachsene zu paaren und nachfolgende Generationen mit hoher Effizienz zu erhalten. Unsere Methode unterstreicht, wie wichtig es ist, die einzigartige Biologie jeder Art für die erfolgreiche Anwendung von Genombearbeitungsmethoden auf nicht-traditionelle Modellorganismen zu berücksichtigen. Wir sagen voraus, dass diese Genom-Editing-Protokolle bei der Implementierung von T. domestica als Labormodell helfen und die Entwicklung und Anwendung nützlicher genetischer Werkzeuge in dieser Spezies weiter beschleunigen werden.

In unseren Händen können etwa 100 Eier gut mit einer einzigen Injektionskapillare injiziert werden, wenn sie die entsprechende Spitze hat (Abbildung 3C). Die Injektion des gRNA/Cas9-Ribonukleoprotein-Komplexes in Embryonen innerhalb der ersten 8 h nach Eiablage führt zu Indels an der gRNA-Zielstelle. Dies führt dazu, dass biallelic Mutationen in einigen Zellen der injizierten Generation (G0) und damit mutierte Mosaik-Phänotypen werden in der Regel in G0 erhalten. Wenn dieses Protokoll b...

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Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

Wir bieten ein detailliertes Protokoll für die Aufzucht, Mikroinjektion von Eiern und für eine effiziente Paarung des Feuerbres Thermobia domestica zur Erzeugung und Aufrechterhaltung mutierter Stämme nach der Genombearbeitung.

Ei-Mikroinjektion und effiziente Mating für die Genombearbeitung im Firebrat Thermobia domestica

The firebrat Thermobia domestica is an ametabolous, wingless species that is suitable for studying the developmental mechanisms of insects that led to ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

4.3K Aufrufe.  Kyoto University. Wir bieten ein detailliertes Protokoll für die Aufzucht, Mikroinjektion von Eiern und für eine effiziente Paarung des Feuerbres Thermobia domestica zur Erzeugung und Aufrechterhaltung mutierter Stämme nach der Genombearbeitung.

Serie: Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Analyse von Zebrafisch-Larven Skelettmuskel Integrität mit Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus embryos are large, develop externally, and can be easily manipulated by microinjection or surgical procedures. In addition, fate maps have been established for early Xenopus embryos. Targeted microinjection into the individual blastomere that will eventually give rise to an organ or tissue of interest can be used to selectively overexpress or knock down gene expression within this restricted region, decreasing secondary effects in the rest of the developing embryo. In this protocol, we describe how to utilize established Xenopus fate maps to target the developing Xenopus kidney (the pronephros), through microinjection into specific blastomere of 4- and 8-cell embryos. Injection of lineage tracers allows verification of the specific targeting of the injection. After embryos have developed to stage 38 - 40, whole-mount immunostaining is used to visualize pronephric development, and the contribution by targeted cells to the pronephros can be assessed. The same technique can be adapted to target other tissue types in addition to the pronephros.

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

Technik auf Zielmikroinjektions an die Entwicklungs<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Identification of Critical Conditions for Immunostaining in the Pea Aphid Embryos: Increasing Tissue Permeability and Decreasing Background Staining

The pea aphid Acyrthosiphon pisum, with a sequenced genome and abundant phenotypic plasticity, has become an emerging model for genomic and developmental studies. Like other aphids, A. pisum propagate rapidly via parthenogenetic viviparous reproduction, where the embryos develop within egg chambers in an assembly-line fashion in the ovariole. Previously we have established a robust platform of whole-mount in situ hybridization allowing detection of mRNA expression in the aphid embryos. For analyzing the expression of protein, though, established protocols for immunostaining the ovarioles of asexual viviparous aphids did not produce satisfactory results. Here we report conditions optimized for increasing tissue permeability and decreasing background staining, both of which were problems when applying established approaches. Optimizations include: (1) incubation of proteinase K (1 &#181;g/ml, 10 min), which was found essential for antibody penetration in mid- and late-stage aphid embryos; (2) replacement of normal goat serum/bovine serum albumin with a blocking reagent supplied by a Digoxigenin (DIG)-based buffer set and (3) application of methanol rather hydrogen peroxide (H2O2) for bleaching endogenous peroxidase; which significantly reduced the background staining in the aphid tissues. These critical conditions optimized for immunostaining will allow effective detection of gene products in the embryos of A. pisum and other aphids.

A protocol of whole-mount immunostaining on aphid embryos is presented, in which critical conditions for decreasing background staining and increasing tissue permeability are addressed. These conditions are specifically developed for effective detection of protein expression in the embryonic tissues of aphids.

Identifizierung kritischer Bedingungen für die Immunfärbung in der Erbsenblattlaus Embryos: Erhöhung Gewebepermeabilität und abnehmender Hintergrundfärbung

The pea aphid Acyrthosiphon pisum, with a sequenced genome and abundant phenotypic plasticity, has become an emerging model for genomic and developmental ...

Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and behavioral phenotypes. The remarkably diverse phenotypes that have evolved as marine populations adapt to countless freshwater environments, combined with the ability to cross marine and freshwater forms, provide a rare vertebrate system in which genetics can be used to map genomic regions controlling evolved traits. Excellent genomic resources are now available, facilitating molecular genetic dissection of evolved changes. While mapping experiments generate lists of interesting candidate genes, functional genetic manipulations are required to test the roles of these genes. Gene regulation can be studied with transgenic reporter plasmids and BACs integrated into the genome using the Tol2 transposase system. Functions of specific candidate genes and cis-regulatory elements can be assessed by inducing targeted mutations with TALEN and CRISPR/Cas9 genome editing reagents. All methods require introducing nucleic acids into fertilized one-cell stickleback embryos, a task made challenging by the thick chorion of stickleback embryos and the relatively small and thin blastomere. Here, a detailed protocol for microinjection of nucleic acids into stickleback embryos is described for transgenic and genome editing applications to study gene expression and function, as well as techniques to assess the success of transgenesis and recover stable lines.

Transgenic manipulations and genome editing are critical for functionally testing the roles of genes and cis-regulatory elements. Here a detailed microinjection protocol for the generation of genomic modifications (including Tol2-mediated fluorescent reporter transgene constructs, TALENs, and CRISPRs) is presented for the emergent model fish, the threespine stickleback.

Mikroinjektions für Transgenese und Genome Editing in Threespine Stichlinge

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance to man of conventional invertebrate model systems and the complexity of genomes in vertebrates are critical challenges to modeling human normal and pathological conditions. The chordate Ciona intestinalis is an invertebrate chordate that emerged from a common ancestor with the vertebrates and may represent features at the interface between invertebrates and vertebrates. A common body plan with much simpler cellular and genomic composition should unveil gene regulatory network (GRN) links and functional genomics readouts explaining phenomena in the vertebrate condition. The compact genome of Ciona, a fixed embryonic lineage with few divisions and large cells, combined with versatile community tools foster efficient gene functional analyses in this organism. Here, we present several crucial methods for this promising model organism, which belongs to the closest sister group to vertebrates. We present protocols for transient transgenesis by electroporation, along with microinjection-mediated gene knockdown, which together provide the means to study gene function and genomic regulatory elements. We extend our protocols to provide information on how community databases are utilized for in silico design of gene regulatory or gene functional experiments. An example study demonstrates how novel information can be gained on the interplay, and its quantification, of selected neural factors conserved between Ciona and man. Furthermore, we show examples of differential subcellular localization in embryonic cells, following DNA electroporation in Ciona zygotes. Finally, we discuss the potential of these protocols to be adapted for tissue specific gene interference with emerging gene editing methods. The in vivo approaches in Ciona overcome major shortcomings of classical model organisms in the quest of unraveling conserved mechanisms in the chordate developmental program, relevant to stem cell research, drug discovery, and subsequent clinical application.

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

We present transient transgenesis and gene knockdown in Ciona intestinalis, a chordate sister group to vertebrates, using microinjection and electroporation techniques. Such methods facilitate functional genomics in this simple invertebrate that features rudimentary characteristics of vertebrates, including notochord and head sensory epithelia, and many orthologs of human disease associated genes.

Embryo Mikroinjektions und Elektroporation in der bei Chor<em&gt; Schlauchseescheide</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

Collection of Post-mating Semen from the Female Reproductive Tract and Measurement of Semen Liquefaction in Mice

In mice, ejaculated semen is deposited in the uterus. After ejaculation, the semen changes consistency from gel-like to watery, a process called liquefaction. In this study, we show how to collect the post-ejaculated semen from the female reproductive tract in a mouse model. First, adult female mice in the estrus stage were housed in a male&#39;s cage overnight. The next morning, copulation was confirmed by the presence of copulatory plug at the vaginal opening. Female mice with copulatory plugs were euthanized, and each reproductive tract was collected as a whole (vagina, uterus, oviducts, ovaries), ensuring a closed system to contain the semen. The reproductive tract was placed in a 1.5 mL microcentrifuge tube, and the vagina was cut off to release the semen into the tube. To ensure maximum semen volume for analysis, toothless forceps were used to squeeze the uterine horns from ovarian end to vaginal end expelling remaining semen. The whole reproductive tract was then discarded. The semen-containing tube was briefly spun down. A 25 &#956;L capillary pipette was placed into the tube at a 180&#176; angle (parallel to the tube wall). The amount of time used to fill the capillary tube to the 25 &#956;L line was recorded. Semen from a proven male breeder usually takes approximately 60-180 s to fill a 25 &#956;L capillary tube. This semen collection technique can also be used in other downstream applications such as sperm imaging and motility analysis.

Semen liquefaction is required for sperm to be liberated from the seminal gel. This study provides the procedures for collecting semen from the female reproductive tract post-coitus, and measuring semen liquefaction time.

Sammlung von Post-Paarung Sperma aus der weiblichen Fortpflanzungsorgane und Messung von Sperma Verflüssigung bei Mäusen

In mice, ejaculated semen is deposited in the uterus. After ejaculation, the semen changes consistency from gel-like to watery, a process called ...

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of cells or tissues in model organisms. These systems contain two components as separate transgenic lines. A driver line expresses a transcriptional activator under the control of tissue-specific promoters/enhancers, and a reporter/effector line harbors a target gene placed downstream to the binding site of the transcription activator. Animals harboring both components induce tissue-specific transactivation of a target gene expression. Precise spatiotemporal expression of the gene in targeted tissues is critical for unbiased interpretation of cell/gene activity. Therefore, developing a method for generating exclusive cell/tissue-specific driver lines is essential. Here we present a method to generate highly tissue-specific targeted expression system by employing a &#34;Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat/CRISPR-associated&#34; (CRISPR/Cas)-based genome editing technique. In this method, the endonuclease Cas9 is targeted by two chimeric guide RNAs (gRNA) to specific sites in the first coding exon of a gene in the Drosophila genome to create double-strand breaks (DSB). Subsequently, using an exogenous donor plasmid containing the transactivator sequence, the cell-autonomous repair machinery enables homology-directed repair (HDR) of the DSB, resulting in precise deletion and replacement of the exon with the transactivator sequence. The knocked-in transactivator is expressed exclusively in cells where the cis-regulatory elements of the replaced gene are functional. The detailed step-by-step protocol presented here for generating a binary transcriptional driver expressed in Drosophila fgf/branchless-producing epithelial/neuronal cells can be adopted for any gene- or tissue-specific expression.

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

Here, we present a method for generating tissue-specific binary transcription systems in Drosophila by replacing the first coding exon of genes with transcription drivers. The CRISPR/Cas9-based method places a transactivator sequence under the endogenous regulation of a replaced gene, and consequently facilitates transctivator expression exclusively in gene-specific spatiotemporal patterns.

Eine wirksame Strategie zur Erzeugung von gewebespezifischen binäre Transkription Systeme in Drosophila von Genom-Bearbeitung

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a general challenge in developmental biology research. In the embryonic heart, this can be particularly difficult as regional differences in the expression of transcriptional regulators, paracrine/juxtacrine signaling cues, and hemodynamic force are all known to influence cardiomyocyte maturation. A simplified method to alter a developing cardiomyocyte's molecular and biomechanical microenvironment would, therefore, serve as a powerful technique to examine how local conditions influence cell fate and function. To address this, we have optimized a method to physically transplant juvenile cardiomyocytes into ectopic locations in the heart or the surrounding embryonic tissue. This allows us to examine how microenvironmental conditions influence cardiomyocyte fate transitions at single cell resolution within the intact embryo. Here, we describe a protocol in which embryonic myocytes can be isolated from a variety of cardiac sub-domains, dissociated, fluorescently labeled, and microinjected into host embryos with high precision. Cells can then be directly analyzed in situ using a variety of imaging and histological techniques. This protocol is a powerful alternative to traditional grafting experiments that can be prohibitively difficult in a moving tissue such as the heart. The general outline of this method can also be adapted to a variety of donor tissues and host environments, and its ease of use, low cost, and speed make it a potentially useful application for a variety of developmental studies.

In this method, embryonic cardiac tissues are surgically microdissected, dissociated, fluorescently labeled, and implanted into host embryonic tissues. This provides a platform for studying the individual or tissue level developmental organization under ectopic hemodynamic conditions, and/or altered paracrine/juxtacrine environments.

Mikroinjektion basierenden System für In Vivo Implantation von embryonalen Kardiomyozyten des aviären Embryos

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Brain Organoid Generation from Induced Pluripotent Stem Cells in Home-Made Mini Bioreactors

The iPSC-derived brain organoid is a promising technology for in vitro modeling the pathologies of the nervous system and drug screening. This technology has emerged recently. It is still in its infancy and has some limitations unsolved yet. The current protocols do not allow obtaining organoids to be consistent enough for drug discovery and preclinical studies. The maturation of organoids can take up to a year, pushing the researchers to launch multiple differentiation processes simultaneously. It imposes additional costs for the laboratory in terms of space and equipment. In addition, brain organoids often have a necrotic zone in the center, which suffers from nutrient and oxygen deficiency. Hence, most current protocols use a circulating system for culture medium to improve nutrition.
Meanwhile, there are no inexpensive dynamic systems or bioreactors for organoid cultivation. This paper describes a protocol for producing brain organoids in compact and inexpensive home-made mini bioreactors. This protocol allows obtaining high quality organoids in large quantities.

Here we describe a protocol for generating brain organoids from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). To obtain brain organoids in large quantities and of high quality, we use home-made mini bioreactors.

Gehirnorganoid-Erzeugung aus induzierten pluripotenten Stammzellen in hausgemachten Mini-Bioreaktoren

The iPSC-derived brain organoid is a promising technology for in vitro modeling the pathologies of the nervous system and drug screening. This technology ...

Zygote Microinjection for Creating Gene Cassette Knock-in and Flox Alleles in Mice

CRISPR-Cas technology has enabled the rapid and effortless generation of genetically modified mice. Specifically, mice and point mutant mice are readily produced by electroporation of CRISPR factors (and single-stranded oligo DNA donors) into the zygote. In contrast, gene cassette (&#62;1 kb) knock-in and floxed mice are mainly generated by microinjection of CRISPR factors and double-stranded DNA donors into zygotes. Genome editing technologies have also increased the flexibility of genetically modified mice production. It is now possible to introduce the intended mutations in the target genomic regions in a number of beneficial inbred mouse strains. Our team has produced over 200 gene cassette knock-in mouse lines, and over 110 floxed mouse lines by zygote microinjection of CRISPR-Cas9 following requests from several countries, including Japan. Some of these genome editing used BALB/c, C3H/HeJ, and C57BL/6N inbred strains, however most used C57BL/6J. Unlike the electroporation method, genome editing by zygote microinjection in various inbred strains of mice is not that easy. However, gene cassette knock-in and floxed mice on single inbred genetic backgrounds are as critical as genetic humanized, fluorescent reporter, and conditional knockout mouse models. Therefore, this article presents the protocol for the zygote microinjection of CRISPR factors and double-stranded DNA donors in C57BL/6J mice for generating gene cassette knock-in and floxed mice. This article exclusively focuses on nuclear injection rather than cytoplasmic injection. In addition to zygote microinjection, we outline the timeline for the production process and peripheral techniques such as induction of superovulation and embryo transfer.

The present protocol describes zygote microinjection of CRISPR-Cas9 and donor DNA to efficiently produce gene cassette knock-in and floxed mice.

Zygoten-Mikroinjektion zur Erzeugung von Genkassetten-, Knock-in- und Flox-Allelen in Mäusen

CRISPR-Cas technology has enabled the rapid and effortless generation of genetically modified mice. Specifically, mice and point mutant mice are readily ...