يسمح لنا هذا البروتوكول بتوليد النمل المعدل وراثيا لفهم وظيفة الجينات في التواصل والسلوك في بيئة اجتماعية. يعد التلاعب بالنظام الجيني للحشرات الاجتماعية أمرا صعبا ، حيث أن العديد من الأنواع لا تتزاوج وتتكاثر في البيئات المختبرية. تسمح لنا مرونة النمط الظاهري المذهلة في أرضية خلية فرط الأنف النملية بإنشاء خطوط متحولة بوساطة كريسبر.
سيوضح الإجراء كايلي سيبر ، طالبة دراسات عليا من المختبر. الحفاظ على مستعمرات من النوع البري من H.saltator في صناديق بلاستيكية شفافة في غرفة تربية النمل في 22 إلى 25 درجة مئوية وضوء 12 ساعة ، 12 ساعة ضوء جدول الإضاءة المظلمة. استخدم الصناديق الصغيرة لتربية العمال الفرديين أو المستعمرات الصغيرة والصناديق المتوسطة أو الكبيرة لتربية المستعمرات الكبيرة.
لإنشاء صناديق عش ، استخدم الجص لصنع الأرضيات. عندما يجف الجص الرطب في الوسط والصناديق الكبيرة ، اضغط على كتلة رغوية في الجص بعمق بضعة سنتيمترات وبضعة سنتيمترات من الجزء الخلفي من الصندوق لتعيين منطقة عش أقل. بمجرد أن يجف الجص ، قم بتغطية منطقة العش المعينة بقطعة مربعة من الزجاج.
قم بإطعام المستعمرات بالصراصير الحية مرتين في الأسبوع ، وقم بتطبيق الماء بانتظام على أرضيات صندوق العش البلاستيكي باستخدام زجاجة غسيل. كلما حدثت التغذية ، قم بإزالة القمامة والأفراد القتلى. قم بتجميد جميع النفايات والنمل الميت طوال الليل عند 30 درجة مئوية تحت الصفر قبل التخلص من هذه المواد كقمامة عادية.
أضف بشكل دوري قليلا من نشارة الخشب المجففة إلى المستعمرات لمساعدة اليرقات أثناء خضوعها للتشرنق ولمساعدة العمال في الحفاظ على نظافة صندوق العش. استخدم مجتذب ماصة صغير لسحب إبر الحقن المجهري الزجاجية. تأكد من أن الزجاج المستخدم قد تم تخزينه في بيئة نظيفة وخالية من الغبار.
استخدم عملية من خطوتين لسحب إبر الحقن المجهري. بالنسبة للخطوة الأولى ، اضبط الحرارة على 575 ، والخيوط على 3 ، والسرعة على 35 ، والتأخير على 145 ، والسحب على 75. بالنسبة للخطوة الثانية ، اضبط الحرارة على 425 ، والخيوط على 0 ، والسرعة على 15 ، والتأخير على 128 ، والسحب على 200.
تأكد من أن الإبرة الناتجة تحتوي على تفتق 2 ملليمتر وطرف 0.5 ميكرومتر. بعد سحب الإبر ، احتفظ بها في بيئة نظيفة وخالية من الغبار حتى الاستخدام. تحضير خليط الحقن الدقيق من بروتينات الكازين والحمض النووي الريبي الدليلي الصغير المركب في المختبر.
احتفظ بالمزيج على الثلج حتى يحين وقت تحميل إبرة الحقن المجهري. عندما لا تكون قيد الاستخدام ، قم بتخزين خليط الحقن الدقيق في درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر. اضبط معلمات الحقن على ضغط حقن قدره 140 هيكتوباسكال ، وضغط ثابت قدره 70 هيكتوباسكال ، وزمن 0.4 ثانية.
اضبط الضغط الثابت بحيث تتدفق المادة في اتجاه واحد فقط ، واضبط ضغط الحقن والوقت فقط إذا لم تتدفق أي مادة من الإبرة إلى الجنين. قم بتحميل إبرة الحقن المجهري باثنين ميكرولتر من الخليط باستخدام أطراف ماصة اللودر الدقيق. افعل ذلك ببطء لضمان عدم تكوين فقاعات في الخليط.
اكسر طرف الإبرة فقط على طول حافة الشريط ، بحيث لا يزال يتم الحفاظ على تفتق ضيق. تأكد من كسر الإبرة بما يكفي لفتح الطرف ، ولكن ليس كثيرا بحيث يتم قطع الاستدقاق. ثم قم بتركيب الإبرة على المناور الصغير.
حدد الأجنة للحقن المجهري من المرحلة المخلوية ، وهي عندما تنقسم النوى دون التحريك الخلوي. قم بتبطين الأجنة على صفيحة من الشريط على الوجهين الملتصقة بشريحة مجهر زجاجي ، مع التأكد من تثبيتها جيدا على الشريط لمنع الحركة أثناء الحقن. ضع الأجنة في اتجاه رأسي بحيث يكون الجانب الجانبي لكل جنين على حافة الشريط.
ضع الشريحة والأجنة المبطنة على مرحلة المجهر في محطة عمل الحقن المجهري المخصصة. قم بمحاذاة الإبرة مع الجنين الأول المراد حقنه باستخدام المعالج الدقيق ، وقم بثقب الجنين الأول جانبيا على طول محوره الظهري أو البطني تحت المجهر. حقن خليط الحقن المجهري ، وابحث عن حركة طفيفة للجنين ، مما يشير إلى زيادة الضغط الداخلي بسبب السائل المحقون.
بالإضافة إلى ذلك ، راقب تكوين قطرة صغيرة تحتوي على آثار مرئية للأنسجة أو الدهون على الغشاء الخارجي للجنين. قم بإزالة الإبرة برفق من الجنين وانتقل إلى الجنين التالي عن طريق ضبط موضع شريحة المجهر. كرر حتى يتم حقن جميع الأجنة.
بمجرد حقن جميع الأجنة الموجودة على الشريحة بنجاح ، انقل الشريحة إلى صندوق رطب لمدة ساعة واحدة لمنح الأجنة وقتا للتعافي قبل إزالتها من الشريحة. بعد الحضانة ، اغسل الشريحة بالإيثانول ، وقم بإزالة الأجنة المحقونة برفق من الشريط باستخدام ملقط وزن الريشة ، وانقلها إلى أنبوب مملوء بكمية صغيرة من الإيثانول بنسبة 70٪. اقلب الأنبوب عدة مرات.
باستخدام فرشاة رسم صغيرة وناعمة ، انقل جميع الأجنة المحقونة إلى ألواح أجار 1٪ مع 2٪ مضاد حيوي مضاد للفطريات. احتضان الألواح عند 25 درجة مئوية لمدة أربعة أسابيع تقريبا ، وتحقق بانتظام من الفقس. بمجرد أن يفقس الجنين الأول إلى يرقة ، أعد جميع الأجنة واليرقات إلى صندوق عش مع عدد قليل من الممرضات الشابات لرعاية الصغار.
الحفاظ على المستعمرة باتباع الأساليب الموضحة سابقا. تم استخدام هذا البروتوكول لإجراء تحرير الجينوم بنجاح في أجنة Harpegnathos saltator. تم التحقق من صحة النتائج عن طريق استنساخ تفاعل البوليميراز المتسلسل و pGEM للحمض النووي المستخرج من الأجنة المحقونة ، يليه تسلسل الحمض النووي.
وصلت كفاءة الطفرات الجسدية باستخدام هذا البروتوكول إلى ما يقرب من 40٪ من الذكور الطافرة F1 تم تزاوجها مع إناث من النوع البري لإنتاج إناث F2 متغايرة الزيجوت والتي ، إذا لم تتزاوج ، أنتجت ذكور F3. تم تزاوج ذكور F3 الطافرة مع الإناث غير المتجانسة الزيجوت لإنتاج إناث متحولة متماثلة الزيجوت F4. نتيجة للطفرات الناجحة ، لوحظت سلوكيات غير عادية مرتبطة بفقدان الجين المستهدف.
يرتبط فقدان Orco بفقدان استشعار الفيرومون ، وعدم القدرة على اكتشاف الفريسة ، وضعف الخصوبة ، والتجول من المستعمرة. عند تنفيذ هذا البروتوكول ، يجب تقليل تلف الجنين أثناء الحقن. يمكن القيام بذلك عن طريق التأكد من عدم فتح طرف الإبرة على نطاق واسع جدا ، وعن طريق تحريك الإبرة ببطء عند الحقن.
يمكن استخدام تقنيات مماثلة لتوليد وصيانة النمل المعدل وراثيا ، مما سيوفر أدوات أكثر تطورا للتحقق من النشاط والسلوك العصبي. تم استخدام تكوين الخلايا العصبية بوساطة كريسبر في أنواع أخرى من الحشرات الاجتماعية ، مثل نحل العسل ، ونملة المهاجم النسيلي ، ونمل النار. ستسهل التعديلات الوراثية الدراسات الوظيفية حول التطور وعلم وظائف الأعضاء والسلوك الاجتماعي في الحشرات eusocial.
