Bu protokol, genlerin sosyal bir ortamda iletişim ve davranıştaki işlevini anlamak için genetiği değiştirilmiş karıncalar üretmemizi sağlar. Ösosyal böceklerin genetik sistemini manipüle etmek zordur, çünkü birçok tür laboratuvar ortamlarında çiftleşmez ve çoğalmaz. Karınca hipernazal hücre tabanındaki çarpıcı fenotip plastisitesi, CRISPR aracılı mutant çizgiler oluşturmamızı sağlar.
Prosedürü gösteren, bir laboratuvardan yüksek lisans öğrencisi olan Kayli Sieber olacak. H.saltator'un vahşi tip kolonilerini, 22 ila 25 santigrat derece arasında bir karınca yetiştirme odasında şeffaf plastik kutularda ve 12 saatlik bir ışık, 12 saatlik karanlık aydınlatma programında tutun. Bireysel işçileri veya küçük kolonileri desteklemek için küçük kutular ve daha büyük kolonileri desteklemek için orta veya büyük kutular kullanın.
Yuva kutuları oluşturmak için, zeminleri yapmak için sıva kullanın. Islak sıva ortamda ve büyük kutularda kuruduğundan, daha düşük bir yuva bölgesi belirlemek için sıvaya birkaç santimetre derinliğinde ve kutunun arkasından birkaç santimetre uzakta bir köpük blok bastırın. Sıva kuruduktan sonra, belirlenen yuva bölgesini kare bir cam parçası ile örtün.
Kolonileri haftada iki kez canlı cırcır böcekleriyle besleyin ve bir yıkama şişesi kullanarak plastik yuva kutusu döşemesine düzenli olarak su uygulayın. Beslenme gerçekleştiğinde, çöpleri ve ölü bireyleri çıkarın. Bu malzemeleri normal çöp olarak atmadan önce tüm atıkları ve ölü karıncaları gece boyunca eksi 30 santigrat derecede dondurun.
Larvaların yavrulaşırken larvalara yardımcı olmak ve işçilerin yuva kutusunu temiz tutmalarına yardımcı olmak için periyodik olarak kolonilere bir tutam kurutulmuş talaş ekleyin. Cam mikroenjeksiyon iğnelerini çekmek için mikro pipet çektirici kullanın. Kullanılan camın tozsuz ve temiz bir ortamda saklandığından emin olun.
Mikroenjeksiyon iğnelerini çekmek için iki aşamalı bir işlem kullanın. İlk adım için, ısıyı 575'e, filamenti 3'e, hızı 35'e, gecikmeyi 145'e ve çekmeyi 75'e ayarlayın. İkinci adım için, ısıyı 425'e, filamenti 0'a, hızı 15'e, gecikmeyi 128'e ve çekmeyi 200'e ayarlayın.
Elde edilen iğnenin 2 milimetrelik bir konik ve 0,5 mikrometrelik bir uca sahip olduğundan emin olun. İğneleri çektikten sonra, kullanana kadar tozsuz ve temiz bir ortamda saklayın. Kazein proteinlerinin ve in vitro sentezlenmiş küçük kılavuz RNA'ların mikroenjeksiyon karışımını hazırlayın.
Bir mikroenjeksiyon iğnesi yükleme zamanı gelene kadar karışımı buz üzerinde tutun. Kullanılmadığında, mikroenjeksiyon karışımını eksi 80 santigrat derecede saklayın. Enjeksiyon parametrelerini 140 hektopaskal enjeksiyon basıncına, 70 hektopaskal sabit basınca ve 0.4 saniyelik bir süreye ayarlayın.
Sabit basıncı, malzemenin yalnızca bir yönde akacağı şekilde ayarlayın ve enjeksiyon basıncını ve süresini yalnızca iğneden embriyoya hiçbir malzeme akmıyorsa ayarlayın. Mikroyükleyici pipet uçlarını kullanarak karışımın iki mikrolitresini içeren bir mikroenjeksiyon iğnesi yükleyin. Karışımda kabarcık oluşmadığından emin olmak için bunu yavaşça yapın.
İğnenin sadece ucunu bandın kenarı boyunca kırın, böylece dar bir konik hala korunur. İğnenin, ucun açılacağı kadar kırıldığından emin olun, ancak konikliğin kırıldığı kadar değil. Ardından iğneyi mikro manipülatöre monte edin.
Sinsityal aşamadan mikroenjeksiyon için embriyoları seçin, bu da çekirdeklerin sitokinezi olmadan bölündüğü zamandır. Embriyoları, bir cam mikroskop slaytına yapışmış çift taraflı bir bant plakası üzerine hizalayın ve enjeksiyon sırasında hareketi önlemek için banda iyi sabitlendiklerinden emin olun. Embriyoları, her embriyonun yanal tarafı bandın kenarında olacak şekilde dikey bir yönde yerleştirin.
Slaytı ve sıralanmış embriyoları, belirlenmiş bir mikroenjeksiyon iş istasyonunda mikroskop sahnesine yerleştirin. İğneyi mikromanipülatör kullanılarak enjekte edilecek ilk embriyo ile hizalayın ve ilk embriyoyu mikroskop altında dorsal veya ventral ekseni boyunca yanal olarak delin. Mikroenjeksiyon karışımını enjekte edin ve embriyonun hafif hareketini arayın, bu da enjekte edilen sıvı nedeniyle iç basınçta bir artış olduğunu gösterir.
Ek olarak, embriyonun dış zarında görünür doku veya lipit izleri içeren küçük bir damlacık oluşumunu izleyin. İğneyi embriyodan yavaşça çıkarın ve mikroskop slaytının konumunu ayarlayarak bir sonraki embriyoya geçin. Tüm embriyolar enjekte edilene kadar tekrarlayın.
Slayttaki tüm embriyolar başarıyla enjekte edildikten sonra, slayttan çıkarılmadan önce embriyolara iyileşmeleri için zaman tanımak için slaytı bir saat boyunca nemli bir kutuya aktarın. Kuluçkadan sonra, slaytı etanol ile yıkayın, enjekte edilen embriyoları tüy ağırlıklı forseps kullanarak banttan yavaşça çıkarın ve az miktarda% 70 etanol ile doldurulmuş bir tüpe aktarın. Tüpü birkaç kez ters çevirin.
Küçük ve yumuşak bir boya fırçası kullanarak, enjekte edilen tüm embriyoları% 2 antibiyotik antimikotik ile% 1 agar plakalarına aktarın. Plakaları yaklaşık dört hafta boyunca 25 santigrat derecede inkübe edin ve kuluçka için düzenli olarak kontrol edin. İlk embriyo bir larvaya yumurtadan çıktıktan sonra, tüm embriyoları ve larvaları, yavrulara bakmak için birkaç genç hemşire işçisiyle birlikte bir yuva kutusuna geri döndürün.
Daha önce gösterilen yöntemleri izleyerek koloniyi koruyun. Bu protokol, Harpegnathos tuzlayıcı embriyolarında genom düzenlemeyi başarıyla gerçekleştirmek için kullanıldı. Sonuçlar, enjekte edilen embriyolardan ekstrakte edilen DNA'nın PCR ve pGEM klonlaması ve ardından DNA dizilimi ile doğrulandı.
Bu protokolü kullanarak somatik mutagenezin etkinliği yaklaşık% 40'a ulaştıF1 mutant erkekler, çiftleşmediği takdirde F3 erkekleri üreten heterozigot F2 dişileri üretmek için vahşi tip dişilerle çiftleştirildi. Mutant F3 erkekleri, F4 homozigot mutant dişileri üretmek için heterozigot dişilerle çiftleştirildi. Başarılı mutagenezin bir sonucu olarak, hedef genin kaybı ile ilişkili olağandışı davranışlar gözlenmiştir.
Orco'nun kaybı, feromon algılama kaybı, avı tespit edememe, bozulmuş doğurganlık ve koloniden dolaşma ile ilişkilidir. Bu protokolü uygularken, enjeksiyon sırasında embriyo hasarının en aza indirilmesi gerekir. Bu, iğne ucunun çok geniş açılmamasını sağlayarak ve enjekte ederken iğneyi yavaşça hareket ettirerek yapılabilir.
Benzer teknikler, nöronal aktivite ve davranışı araştırmak için daha sofistike araçlar sağlayacak olan transgenik karıncaları üretmek ve sürdürmek için kullanılabilir. CRISPR aracılı nörogenez, bal arıları, klonal akıncı karınca ve ateş karıncaları gibi diğer ösosyal böcek türlerinde kullanılmıştır. Genetik modifikasyonlar, ösosyal böceklerde gelişim, fizyoloji ve sosyal davranış üzerine fonksiyonel çalışmaları kolaylaştıracaktır.
