Dieses Protokoll ermöglicht es uns, genetisch veränderte Ameisen zu erzeugen, um die Funktion von Genen in Kommunikation und Verhalten in einem sozialen Umfeld zu verstehen. Die Manipulation des genetischen Systems eusozialer Insekten ist eine Herausforderung, da sich viele Arten im Labor nicht paaren und vermehren. Die auffallende Phänotyp-Plastizität im hypernasalen Zellboden der Ameisen ermöglicht es uns, CRISPR-vermittelte Mutantenlinien zu etablieren.
Kayli Sieber, Doktorandin aus einem Labor, demonstriert das Verfahren. Pflegen Sie Wildtyp-Kolonien von H.saltator in transparenten Plastikboxen in einem Ameisenaufzuchtraum bei 22 bis 25 Grad Celsius und einem 12-Stunden-Licht- und 12-Stunden-Dunkellichtplan. Verwenden Sie kleine Boxen, um einzelne Arbeiter oder kleine Kolonien aufzuziehen, und mittlere oder große Boxen, um größere Kolonien aufzuziehen.
Um Nistkästen zu erstellen, verwenden Sie Gips, um die Böden zu machen. Da der nasse Pflaster im Medium und in den großen Kästen trocknet, drücken Sie einen Schaumstoffblock einige Zentimeter tief und einige Zentimeter von der Rückseite des Kastens in den Putz, um einen unteren Nestbereich zu bezeichnen. Sobald der Gips getrocknet ist, bedecken Sie den vorgesehenen Nestbereich mit einem quadratischen Stück Glas.
Füttern Sie die Kolonien zweimal pro Woche mit lebenden Grillen und tragen Sie regelmäßig Wasser mit einer Waschflasche auf den Boden des Kunststoff-Nistkastens auf. Wann immer die Fütterung stattfindet, entfernen Sie Müll und tote Individuen. Frieren Sie alle Abfälle und toten Ameisen über Nacht bei minus 30 Grad Celsius ein, bevor Sie diese Materialien als normalen Müll entsorgen.
Fügen Sie den Kolonien regelmäßig eine Prise getrocknetes Sägemehl hinzu, um den Larven bei der Verpuppung zu helfen und den Arbeitern zu helfen, den Nistkasten sauber zu halten. Verwenden Sie einen Mikropipettenzieher, um Glas-Mikroinjektionsnadeln zu ziehen. Stellen Sie sicher, dass das verwendete Glas in einer staubfreien und sauberen Umgebung gelagert wurde.
Verwenden Sie einen zweistufigen Prozess, um Mikroinjektionsnadeln zu ziehen. Stellen Sie für den ersten Schritt die Wärme auf 575, das Filament auf 3, die Geschwindigkeit auf 35, die Verzögerung auf 145 und den Zug auf 75 ein. Stellen Sie für den zweiten Schritt die Wärme auf 425, das Filament auf 0, die Geschwindigkeit auf 15, die Verzögerung auf 128 und den Zug auf 200.
Stellen Sie sicher, dass die resultierende Nadel eine 2-Millimeter-Verjüngung und eine Spitze von 0,5 Mikrometern hat. Nachdem Sie die Nadeln gezogen haben, bewahren Sie sie bis zum Gebrauch in einer staubfreien und sauberen Umgebung auf. Bereiten Sie die Mikroinjektionsmischung aus Caseinproteinen und in-vitro synthetisierten kleinen Guide-RNAs vor.
Halten Sie die Mischung auf Eis, bis es Zeit ist, eine Mikroinjektionsnadel zu laden. Bei Nichtgebrauch das Mikroinjektionsgemisch bei minus 80 Grad Celsius lagern. Stellen Sie die Injektionsparameter auf einen Injektionsdruck von 140 Hektopascale, einen konstanten Druck von 70 Hektopascal und eine Zeit von 0,4 Sekunden ein.
Stellen Sie den konstanten Druck so ein, dass das Material nur in eine Richtung fließt, und passen Sie den Injektionsdruck und die Zeit nur an, wenn kein Material von der Nadel in den Embryo fließt. Beladen Sie eine Mikroinjektionsnadel mit zwei Mikrolitern der Mischung unter Verwendung von Mikroladerpipettenspitzen. Tun Sie dies langsam, um sicherzustellen, dass sich keine Blasen in der Mischung bilden.
Brechen Sie nur die Spitze der Nadel entlang der Bandkante, so dass eine schmale Verjüngung noch erhalten bleibt. Stellen Sie sicher, dass die Nadel gerade so weit gebrochen ist, dass die Spitze geöffnet wird, aber nicht so sehr, dass die Verjüngung abgebrochen ist. Dann montieren Sie die Nadel am Mikromanipulator.
Wählen Sie Embryonen für die Mikroinjektion aus dem Synzytialstadium aus, bei dem sich die Kerne ohne Zytokinese teilen. Legen Sie die Embryonen auf einer Platte aus doppelseitigem Klebeband aus, die an einem Glasmikroskopobjektträger befestigt ist, und stellen Sie sicher, dass sie gut am Klebeband befestigt sind, um Bewegungen während der Injektion zu verhindern. Legen Sie die Embryonen in eine vertikale Ausrichtung, so dass sich die laterale Seite jedes Embryos am Rand des Bandes befindet.
Legen Sie den Objektträger und die ausgekleideten Embryonen an einem dafür vorgesehenen Mikroinjektionsarbeitsplatz auf den Tisch des Mikroskops. Richten Sie die Nadel mit dem ersten Embryo aus, der mit dem Mikromanipulator injiziert wird, und punktieren Sie den ersten Embryo seitlich entlang seiner dorsalen oder ventralen Achse unter einem Mikroskop. Injizieren Sie die Mikroinjektionsmischung und achten Sie auf eine leichte Bewegung des Embryos, was auf einen Anstieg des Innendrucks aufgrund der injizierten Flüssigkeit hinweist.
Achten Sie außerdem auf die Bildung eines kleinen Tröpfchens mit sichtbaren Spuren von Gewebe oder Lipiden auf der äußeren Membran des Embryos. Entfernen Sie vorsichtig die Nadel vom Embryo und fahren Sie mit dem nächsten Embryo fort, indem Sie die Position des Objektträgers anpassen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Embryonen injiziert wurden.
Sobald alle Embryonen auf dem Objektträger erfolgreich injiziert wurden, geben Sie den Objektträger für eine Stunde in eine feuchte Box, um den Embryonen Zeit zu geben, sich zu erholen, bevor sie aus dem Objektträger entnommen werden. Nach der Inkubation waschen Sie den Objektträger mit Ethanol, entfernen Sie die injizierten Embryonen vorsichtig mit einer federleichten Pinzette vom Band und übertragen Sie sie in ein Röhrchen, das mit einer kleinen Menge 70% Ethanol gefüllt ist. Drehen Sie die Röhre mehrmals um.
Übertragen Sie alle injizierten Embryonen mit einem kleinen und weichen Pinsel auf 1% Agarplatten mit 2% antibiotischen Antimykotika. Inkubieren Sie die Platten bei 25 Grad Celsius für etwa vier Wochen und überprüfen Sie regelmäßig das Schlüpfen. Sobald der erste Embryo zu einer Larve geschlüpft ist, bringen Sie alle Embryonen und Larven mit ein paar jungen Krankenschwestern in einen Nistkasten zurück, um sich um die Jungtiere zu kümmern.
Pflegen Sie die Kolonie nach den zuvor demonstrierten Methoden. Dieses Protokoll wurde verwendet, um erfolgreich Genome Editing in Harpegnathos saltator Embryonen durchzuführen. Die Ergebnisse wurden mittels PCR- und pGEM-Klonierung von DNA validiert, die aus injizierten Embryonen extrahiert wurde, gefolgt von DNA-Sequenzierung.
Die Effizienz der somatischen Mutagenese unter Verwendung dieses Protokolls erreichte etwa 40%F1-mutierte Männchen wurden mit Wildtyp-Weibchen verpaart, um heterozygote F2-Weibchen zu produzieren, die, wenn sie nicht gepaart wurden, F3-Männchen produzierten. Mutierte F3-Männchen wurden mit heterozygoten Weibchen verpaart, um F4-homozygote mutierte Weibchen zu erzeugen. Als Ergebnis der erfolgreichen Mutagenese wurden ungewöhnliche Verhaltensweisen beobachtet, die mit dem Verlust des Zielgens korrelierten.
Der Verlust von Orco ist mit einem Verlust der Pheromonwahrnehmung, der Unfähigkeit, Beute zu erkennen, einer beeinträchtigten Fruchtbarkeit und dem Abwandern von der Kolonie verbunden. Bei der Durchführung dieses Protokolls müssen Embryoschäden während der Injektion minimiert werden. Dies kann erreicht werden, indem sichergestellt wird, dass die Nadelspitze nicht zu weit geöffnet wird, und indem die Nadel beim Injizieren langsam bewegt wird.
Ähnliche Techniken können verwendet werden, um transgene Ameisen zu erzeugen und zu erhalten, die ausgefeiltere Werkzeuge zur Untersuchung neuronaler Aktivität und Verhalten bieten. CRISPR-vermittelte Neurogenese wurde bei anderen eusozialen Insektenarten wie Honigbienen, klonaler Räuberameise und Feuerameisen eingesetzt. Genetische Veränderungen werden die funktionellen Studien zu Entwicklung, Physiologie und Sozialverhalten bei eusozialen Insekten erleichtern.
