Ce protocole nous permet de générer des fourmis génétiquement modifiées pour comprendre la fonction des gènes dans la communication et le comportement dans un environnement social. La manipulation du système génétique des insectes eusociaux est difficile, car de nombreuses espèces ne s’accouplent pas et ne se reproduisent pas en laboratoire. La plasticité phénotypique frappante dans le plancher cellulaire hypernasal de la fourmi nous permet d’établir des lignées mutantes médiées par CRISPR.
La démonstration de la procédure sera Kayli Sieber, une étudiante diplômée d’un laboratoire. Maintenir des colonies sauvages de H. saltator dans des boîtes en plastique transparent dans une salle d’élevage de fourmis à 22 à 25 degrés Celsius et un horaire d’éclairage léger de 12 heures et 12 heures d’éclairage sombre. Utilisez de petites boîtes pour élever des ouvrières individuelles ou de petites colonies et des boîtes moyennes ou grandes pour élever de plus grandes colonies.
Pour créer des nichoirs, utilisez du plâtre pour faire les planchers. Pendant que le plâtre humide sèche dans le milieu et les grandes boîtes, pressez un bloc de mousse dans le plâtre à quelques centimètres de profondeur et à quelques centimètres de l’arrière de la boîte pour désigner une région de nidification inférieure. Une fois le plâtre séché, couvrez la région de nidification désignée avec un morceau de verre carré.
Nourrissez les colonies avec des grillons vivants deux fois par semaine et appliquez régulièrement de l’eau sur le sol en plastique des nichoirs à l’aide d’un biberon. Chaque fois qu’il y a de l’alimentation, enlevez les ordures et les personnes mortes. Congelez tous les déchets et les fourmis mortes pendant la nuit à moins 30 degrés Celsius avant de jeter ces matières comme ordures ordinaires.
Ajoutez périodiquement une pincée de sciure de bois séchée aux colonies pour aider les larves à subir une nymphose et pour aider les ouvrières à garder le nichoir propre. Utilisez un extracteur de micropipettes pour tirer les aiguilles de micro-injection en verre. Assurez-vous que le verre utilisé a été stocké dans un environnement propre et exempt de poussière.
Utilisez un processus en deux étapes pour tirer les aiguilles de micro-injection. Pour la première étape, réglez la chaleur sur 575, le filament sur 3, la vitesse sur 35, le retard sur 145 et la traction sur 75. Pour la deuxième étape, réglez la chaleur sur 425, le filament sur 0, la vitesse sur 15, le retard sur 128 et la traction sur 200.
Assurez-vous que l’aiguille résultante a une conicité de 2 millimètres et une pointe de 0,5 micromètre. Après avoir tiré les aiguilles, gardez-les dans un environnement exempt de poussière et propre jusqu’à utilisation. Préparer le mélange de micro-injection de protéines de caséine et de petits ARN guides synthétisés in vitro.
Gardez le mélange sur la glace jusqu’à ce qu’il soit temps de charger une aiguille de micro-injection. Lorsqu’il n’est pas utilisé, conservez le mélange de micro-injection à moins 80 degrés Celsius. Réglez les paramètres d’injection sur une pression d’injection de 140 hectopascal, une pression constante de 70 hectopascal et un temps de 0,4 seconde.
Ajustez la pression constante de manière à ce que le matériau ne circule que dans une direction et ajustez la pression et le temps d’injection uniquement si aucun matériau ne s’écoule de l’aiguille dans l’embryon. Chargez une aiguille de micro-injection avec deux microlitres du mélange à l’aide d’embouts de pipette de microchargeur. Faites-le lentement pour vous assurer qu’aucune bulle ne se forme dans le mélange.
Cassez juste la pointe de l’aiguille le long du bord du ruban, de sorte qu’une conicité étroite soit toujours maintenue. Assurez-vous que l’aiguille est cassée juste assez pour que la pointe soit ouverte, mais pas au point que la conicité soit cassée. Montez ensuite l’aiguille sur le micro manipulateur.
Sélectionner les embryons pour la micro-injection à partir du stade syncytial, c’est-à-dire lorsque les noyaux se divisent sans cytocinèse. Tapisser les embryons sur une plaque de ruban adhésif double face collée à une lame de microscope en verre, en s’assurant qu’ils sont bien fixés à la bande pour empêcher tout mouvement pendant l’injection. Déposer les embryons dans une orientation verticale de telle sorte que le côté latéral de chaque embryon soit au bord de la bande.
Placez la lame et les embryons doublés sur la scène du microscope à un poste de travail de micro-injection désigné. Alignez l’aiguille avec le premier embryon à injecter à l’aide du micromanipulateur et percez latéralement le premier embryon le long de son axe dorsal ou ventral au microscope. Injectez le mélange de micro-injection et recherchez un léger mouvement de l’embryon, indiquant une augmentation de la pression interne due au liquide injecté.
De plus, surveillez la formation d’une petite gouttelette contenant des traces visibles de tissu ou de lipides sur la membrane externe de l’embryon. Retirez doucement l’aiguille de l’embryon et passez à l’embryon suivant en ajustant la position de la lame de microscope. Répéter jusqu’à ce que tous les embryons aient été injectés.
Une fois que tous les embryons de la lame ont été injectés avec succès, transférez la lame dans une boîte humide pendant une heure pour donner aux embryons le temps de récupérer avant d’être retirés de la lame. Après l’incubation, lavez la lame avec de l’éthanol, retirez doucement les embryons injectés du ruban à l’aide d’une pince à poids plume et transférez-les dans un tube rempli d’une petite quantité d’éthanol à 70%. Inversez le tube plusieurs fois.
À l’aide d’un petit pinceau souple, transférer tous les embryons injectés dans des plaques de gélose à 1% contenant 2% d’antimycotique antibiotique. Incuber les plaques à 25 degrés Celsius pendant environ quatre semaines, en vérifiant régulièrement l’éclosion. Une fois que le premier embryon a éclos en larve, remettez tous les embryons et les larves dans un nichoir avec quelques jeunes infirmières pour s’occuper des nouveau-nés.
Maintenir la colonie en suivant les méthodes précédemment démontrées. Ce protocole a été utilisé pour effectuer avec succès l’édition du génome dans des embryons salateurs d’Harpegnathos. Les résultats ont été validés par PCR et clonage pGEM de l’ADN extrait d’embryons injectés, suivi d’un séquençage de l’ADN.
L’efficacité de la mutagénèse somatique à l’aide de ce protocole a atteint environ 40% des mâles mutants F1 ont été accouplés à des femelles de type sauvage pour produire des femelles F2 hétérozygotes qui, si elles ne sont pas accouplées, ont produit des mâles F3. Les mâles F3 mutants ont été accouplés à des femelles hétérozygotes pour produire des femelles mutantes homozygotes F4. À la suite d’une mutagénèse réussie, des comportements inhabituels corrélés à la perte du gène cible ont été observés.
La perte d’Orco est associée à une perte de détection des phéromones, à l’incapacité de détecter les proies, à une fécondité altérée et à l’errance de la colonie. Lors de l’exécution de ce protocole, les dommages aux embryons pendant l’injection doivent être minimisés. Cela peut être fait en s’assurant que la pointe de l’aiguille n’est pas trop ouverte trop largement, et en déplaçant l’aiguille lentement lors de l’injection.
Des techniques similaires peuvent être utilisées pour générer et maintenir des fourmis transgéniques, ce qui fournira des outils plus sophistiqués pour sonder l’activité et le comportement neuronaux. La neurogenèse médiée par CRISPR a été utilisée chez d’autres espèces d’insectes eusociaux, telles que les abeilles mellifères, les fourmis pileuses clonales et les fourmis de feu. Les modifications génétiques faciliteront les études fonctionnelles sur le développement, la physiologie et le comportement social chez les insectes eusociaux.
