Questo protocollo ci consente di generare formiche geneticamente modificate per comprendere la funzione dei geni nella comunicazione e nel comportamento in un ambiente sociale. Manipolare il sistema genetico degli insetti eusociali è impegnativo, poiché molte specie non si accoppiano e si riproducono in laboratorio. La sorprendente plasticità fenotipica nel pavimento delle cellule ipernasali delle formiche ci consente di stabilire linee mutanti mediate da CRISPR.
A dimostrare la procedura sarà Kayli Sieber, uno studente laureato da un laboratorio. Mantenere le colonie selvatiche di H.saltator in scatole di plastica trasparente in una stanza di allevamento delle formiche a 22-25 gradi Celsius e un programma di illuminazione scura di 12 ore e 12 ore. Utilizzare piccole scatole per allevare singoli lavoratori o piccole colonie e scatole medie o grandi per allevare colonie più grandi.
Per creare cassette nido, utilizzare l'intonaco per realizzare i pavimenti. Mentre l'intonaco bagnato si sta asciugando nelle scatole medie e grandi, premere un blocco di schiuma nell'intonaco a pochi centimetri di profondità e a pochi centimetri dal retro della scatola per designare una regione di nido inferiore. Una volta che l'intonaco si è asciugato, coprire la regione del nido designata con un pezzo di vetro quadrato.
Nutrire le colonie con grilli vivi due volte a settimana e applicare regolarmente acqua sul pavimento della cassetta nido di plastica usando una bottiglia di lavaggio. Ogni volta che si verifica l'alimentazione, rimuovere la spazzatura e gli individui morti. Congelare tutti i rifiuti e le formiche morte durante la notte a meno 30 gradi Celsius prima di smaltire questi materiali come spazzatura normale.
Aggiungere periodicamente un pizzico di segatura essiccata alle colonie per aiutare le larve mentre subiscono la pupa e per aiutare i lavoratori a mantenere pulita la cassetta nido. Utilizzare un estrattore di micro pipette per tirare gli aghi di microiniezione di vetro. Assicurarsi che il vetro utilizzato sia stato conservato in un ambiente pulito e privo di polvere.
Utilizzare un processo in due fasi per tirare gli aghi di microiniezione. Per il primo passo, impostare il calore su 575, il filamento su 3, la velocità su 35, il ritardo su 145 e l'attrazione su 75. Per il secondo passaggio, impostare il calore su 425, il filamento su 0, la velocità su 15, il ritardo su 128 e l'attrazione su 200.
Assicurarsi che l'ago risultante abbia una conicità di 2 millimetri e una punta di 0,5 micrometri. Dopo aver tirato gli aghi, tenerli in un ambiente privo di polvere e pulito fino all'uso. Preparare la miscela di microiniezione di proteine della caseina e piccoli RNA guida sintetizzati in vitro.
Tenere la miscela su ghiaccio fino al momento di caricare un ago per microiniezione. Quando non in uso, conservare la miscela di microiniezione a meno 80 gradi Celsius. Impostare i parametri di iniezione su una pressione di iniezione di 140 ettopasco, una pressione costante di 70 ettopascal e un tempo di 0,4 secondi.
Regolare la pressione costante in modo che il materiale scorra solo in una direzione e regolare la pressione e il tempo di iniezione solo se nessun materiale scorre dall'ago all'embrione. Caricare un ago per microiniezione con due microlitri di miscela utilizzando le punte delle pipette microloader. Fallo lentamente per assicurarti che non si formino bolle nella miscela.
Rompere solo la punta dell'ago lungo il bordo del nastro, in modo tale che venga ancora mantenuta una cono stretta. Assicurarsi che l'ago sia rotto quel tanto che basta per aprire la punta, ma non così tanto da rompere la conicità. Quindi montare l'ago sul micro manipolatore.
Selezionare gli embrioni per la microiniezione dalla fase sinciziale, che è quando i nuclei si dividono senza citochinesi. Rivestire gli embrioni su una lastra di nastro biadesivo attaccata a un vetrino da microscopio, assicurandosi che siano ben fissati al nastro per impedire il movimento durante l'iniezione. Disporre gli embrioni in un orientamento verticale in modo tale che il lato laterale di ciascun embrione sia sul bordo del nastro.
Posizionare il vetrino e gli embrioni allineati sul palco del microscopio in una postazione di microiniezione designata. Allineare l'ago con il primo embrione da iniettare usando il micromanipolatore e perforare lateralmente il primo embrione lungo il suo asse dorsale o ventrale al microscopio. Iniettare la miscela di microiniezione e cercare un leggero movimento dell'embrione, indicando un aumento della pressione interna dovuta al liquido iniettato.
Inoltre, osservare la formazione di una piccola goccia contenente tracce visibili di tessuto o lipidi sulla membrana esterna dell'embrione. Rimuovere delicatamente l'ago dall'embrione e procedere all'embrione successivo regolando la posizione del vetrino del microscopio. Ripetere fino a quando tutti gli embrioni sono stati iniettati.
Una volta che tutti gli embrioni sul vetrino sono stati iniettati con successo, trasferire il vetrino in una scatola umida per un'ora per dare agli embrioni il tempo di riprendersi prima di essere rimossi dal vetrino. Dopo l'incubazione, lavare il vetrino con etanolo, rimuovere delicatamente gli embrioni iniettati dal nastro usando una pinza leggera come una piuma e trasferirli in un tubo riempito con una piccola quantità di etanolo al 70%. Capovolgere il tubo più volte.
Utilizzando un pennello piccolo e morbido, trasferire tutti gli embrioni iniettati in piastre di agar all'1% con antimicotico antibiotico al 2%. Incubare le piastre a 25 gradi Celsius per circa quattro settimane, controllando regolarmente la schiusa. Una volta che il primo embrione si è schiuso in una larva, riportare tutti gli embrioni e le larve in una cassetta nido con alcune giovani infermiere per prendersi cura dei piccoli.
Mantenere la colonia seguendo i metodi precedentemente dimostrati. Questo protocollo è stato utilizzato per eseguire con successo l'editing del genoma negli embrioni di Harpegnathos saltator. I risultati sono stati convalidati tramite PCR e clonazione pGEM del DNA estratto da embrioni iniettati, seguito dal sequenziamento del DNA.
L'efficienza della mutagenesi somatica utilizzando questo protocollo ha raggiunto circa il 40% I maschi mutanti F1 sono stati accoppiati con femmine wild type per produrre femmine F2 eterozigoti che, se non accoppiate, hanno prodotto maschi F3. I maschi mutanti F3 sono stati accoppiati con femmine eterozigoti per produrre femmine mutanti omozigoti F4. Come risultato della mutagenesi di successo, sono stati osservati comportamenti insoliti correlati alla perdita del gene bersaglio.
La perdita di Orco è associata a una perdita di rilevamento dei feromoni, incapacità di rilevare la preda, fecondità compromessa e vagabondaggio dalla colonia. Quando si esegue questo protocollo, il danno embrionale durante l'iniezione deve essere ridotto al minimo. Questo può essere fatto assicurandosi che la punta dell'ago non sia troppo aperta e muovendo lentamente l'ago durante l'iniezione.
Tecniche simili possono essere utilizzate per generare e mantenere formiche transgeniche, che forniranno strumenti più sofisticati per sondare l'attività e il comportamento neuronale. La neurogenesi mediata da CRISPR è stata utilizzata in altre specie di insetti eusociali, come le api, le formiche razziatrici clonali e le formiche di fuoco. Le modificazioni genetiche faciliteranno gli studi funzionali sullo sviluppo, la fisiologia e il comportamento sociale negli insetti eusociali.
