פרוטוקול זה מאפשר לנו ליצור נמלים מהונדסות גנטית כדי להבין את תפקידם של גנים בתקשורת ובהתנהגות בסביבה חברתית. מניפולציה של המערכת הגנטית של חרקים אאוסוציאליים היא מאתגרת, מכיוון שמינים רבים אינם מזדווגים ומתרבים בסביבות מעבדה. הפלסטיות הפנוטיפית המרשימה ברצפת התא ההיפר-נסאלי של הנמלה מאפשרת לנו ליצור קווים מוטנטיים בתיווך קריספר.
מי שתדגים את ההליך תהיה קיילי סייבר, סטודנטית לתואר שני במעבדה. שמרו על מושבות פראיות של H.saltator בקופסאות פלסטיק שקופות בחדר גידול נמלים בטמפרטורה של 22 עד 25 מעלות צלזיוס ולוח זמנים של 12 שעות אור, 12 שעות תאורה חשוכה. השתמש בקופסאות קטנות כדי לגדל עובדים בודדים או מושבות קטנות וקופסאות בינוניות או גדולות כדי לגדל מושבות גדולות יותר.
ליצירת תיבות קינון, השתמשו בטיח ליצירת הרצפות. כאשר הטיח הרטוב מתייבש בקופסאות הבינוניות והגדולות, לחצו גוש קצף לתוך הטיח בעומק של כמה סנטימטרים וכמה סנטימטרים מהחלק האחורי של הקופסה כדי לייעד אזור קן תחתון. לאחר שהטיח התייבש, מכסים את אזור הקן המיועד בחתיכת זכוכית מרובעת.
האכילו מושבות בצרצרים חיים פעמיים בשבוע, ומרחו מים באופן קבוע על רצפת תיבת הקן מפלסטיק באמצעות בקבוק כביסה. בכל פעם שמתרחשת האכלה, הסר אשפה ואנשים מתים. הקפיאו את כל הפסולת והנמלים המתות למשך הלילה בטמפרטורה של מינוס 30 מעלות צלזיוס לפני השלכת חומרים אלה כאשפה רגילה.
מדי פעם מוסיפים קמצוץ של נסורת מיובשת למושבות כדי לעזור לזחלים בזמן שהם עוברים גורים וכדי לעזור לעובדים לשמור על תיבת הקן נקייה. השתמש במושך מיקרו פיפטה כדי למשוך מחטי מיקרו הזרקה מזכוכית. ודא שהזכוכית שבה נעשה שימוש אוחסנה בסביבה נקייה ונטולת אבק.
השתמש בתהליך בן שני שלבים כדי למשוך מחטי מיקרו-הזרקה. עבור הצעד הראשון, הגדר את החום ל-575, נימה ל-3, מהירות ל-35, השהיה ל-145 ומשיכה ל-75. עבור השלב השני, הגדר את החום ל -425, נימה ל-0, מהירות ל-15, השהיה ל-128 ומשיכה ל-200.
ודא כי המחט המתקבלת יש מחודד 2 מילימטר וקצה של 0.5 מיקרומטר. לאחר משיכת המחטים, יש לשמור אותן בסביבה נקייה ונטולת אבק עד לשימוש. הכינו את תערובת המיקרו-הזרקות של חלבוני קזאין ורנ"א מסונתזים קטנים מסונתזים.
שומרים את התערובת על קרח עד שהגיע הזמן לטעון מחט מיקרו-הזרקה. כאשר אינה בשימוש, יש לאחסן את תערובת המיקרו-הזרקה בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס. הגדר את פרמטרי ההזרקה ללחץ הזרקה של 140 הקטופסקל, לחץ קבוע של 70 הקטופסקל, וזמן של 0.4 שניות.
התאימו לחץ קבוע כך שהחומר יזרום רק בכיוון אחד, והתאימו את לחץ ההזרקה ואת הזמן רק אם אין חומר שזורם מהמחט לתוך העובר. טען מחט מיקרו-הזרקה עם שני מיקרוליטרים של התערובת באמצעות קצוות פיפטה microloader. עשו זאת באיטיות כדי להבטיח שלא ייווצרו בועות בתערובת.
לשבור רק את קצה המחט לאורך קצה הקלטת, כך מתחדד צר עדיין נשמר. ודא שהמחט שבורה מספיק כדי שהקצה ייפתח, אבל לא עד כדי כך שהמחטט נשבר. ואז להרכיב את המחט על מניפולטור מיקרו.
בחר עוברים למיקרו-הזרקה מהשלב הסינסיטיאלי, שבו גרעינים מתחלקים ללא ציטוקיניזה. מרפדים את העוברים על צלחת של סרט דו-צדדי המודבק למגלשה של מיקרוסקופ זכוכית, ומוודאים שהם מחוברים היטב לקלטת כדי למנוע תזוזה במהלך ההזרקה. הניחו את העוברים בכיוון אנכי כך שהצד הצדדי של כל עובר נמצא בקצה הקלטת.
הניחו את המגלשה ואת העוברים המרופדים על במת המיקרוסקופ בתחנת עבודה ייעודית למיקרו-הזרקה. יישרו את המחט עם העובר הראשון שיוזרק באמצעות המיקרומניפולטור, ונקבו לרוחב את העובר הראשון לאורך הציר הגבי או הגחוני שלו תחת מיקרוסקופ. להזריק את תערובת microinjection, ולחפש תנועה קלה של העובר, המציין עלייה בלחץ הפנימי עקב הנוזל מוזרק.
בנוסף, שימו לב להיווצרות טיפה קטנה המכילה עקבות גלויים של רקמה או שומנים על הממברנה החיצונית של העובר. הסר בעדינות את המחט מהעובר והמשך לעובר הבא על ידי התאמת מיקום המיקרוסקופ. יש לחזור על הפעולה עד להזרקת כל העוברים.
לאחר שכל העוברים בשקופית הוזרקו בהצלחה, העבירו את השקופית לקופסה לחה למשך שעה אחת כדי לתת לעוברים זמן להתאושש לפני שהוסרו מהשקופית. לאחר הדגירה, לשטוף את המגלשה עם אתנול, בעדינות להסיר את העוברים מוזרקים מן הקלטת באמצעות מלקחיים במשקל נוצה, ולהעביר אותם צינור מלא כמות קטנה של 70% אתנול. הפוך את הצינור מספר פעמים.
באמצעות מכחול קטן ורך, העבירו את כל העוברים המוזרקים לצלחות 1% אגר עם 2% אנטיביוטיקה אנטי-מיקוטית. דגירה של הצלחות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס במשך כארבעה שבועות, תוך בדיקה קבועה של הבקיעה. לאחר שהעובר הראשון בקע לזחל, החזירו את כל העוברים והזחלים לתיבת קן עם כמה אחיות צעירות שיטפלו באבקועים.
לתחזק את המושבה בהתאם לשיטות שהודגמו בעבר. פרוטוקול זה שימש לביצוע מוצלח של עריכת גנום בעוברי מלח Harpegnathos. התוצאות אומתו באמצעות שיבוט PCR ו-pGEM של דנ"א שחולץ מעוברים מוזרקים, ולאחר מכן ריצוף דנ"א.
היעילות של מוטגנזה סומטית באמצעות פרוטוקול זה הגיעה לכ-40% זכרים מוטנטים מסוג F1 הזדווגו לנקבות מסוג בר כדי לייצר נקבות F2 הטרוזיגוטיות אשר, אם לא הזדווגו, הפיקו זכרי F3. זכרי F3 מוטנטים הזדווגו עם נקבות הטרוזיגוטיות כדי לייצר נקבות מוטנטיות הומוזיגוטיות F4. כתוצאה ממוטגנזה מוצלחת, נצפו התנהגויות חריגות המתואמות עם אובדן גן המטרה.
אובדן אורקו קשור לאובדן של חישת פרומון, חוסר יכולת לזהות טרף, פגיעה בצואה ונדידה מהמושבה. בעת ביצוע פרוטוקול זה, יש למזער את נזקי העובר במהלך ההזרקה. ניתן לעשות זאת על ידי הקפדה על כך שקצה המחט לא ייפתח לרווחה מדי, ועל ידי הזזת המחט באיטיות בעת ההזרקה.
ניתן להשתמש בטכניקות דומות כדי ליצור ולתחזק נמלים מהונדסות, אשר יספקו כלים מתוחכמים יותר לחקר הפעילות וההתנהגות העצבית. נוירוגנזה בתיווך קריספר שימשה במיני חרקים אאו-סוציאליים אחרים, כגון דבורי דבש, נמלת שודדי השן ונמלי אש. שינויים גנטיים יאפשרו את המחקרים הפונקציונליים על התפתחות, פיזיולוגיה והתנהגות חברתית בחרקים אאוסוציאליים.
