يمكن استخدام هذا النهج في نماذج نظام الخلية لإجهاد الشبكة الإندوبلازمية عن طريق التلاعب بالتعبير الجزيئي لمكونات زوج المصب. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي إزالة تأثير الإشارات المقترنة عن طريق تصور وقياس المسارات العصبية. يمكن أن تساهم هذه الطريقة في فهم الأساس الجزيئي للانتقال بين المراحل الحادة والمزمنة من إجهاد ER في نماذج الأمراض التنكسية العصبية المتنوعة إلى جانب العقدة العقدية GM2 للبدء ، تشريح الأنسجة تحت عدسة مكبرة 20X مع اثنين من الملقط رقم خمسة طرف دقيق ، وفصل القشرة الأمامية عن السحايا.
انقل القشرة الأمامية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر واحتضن الأنسجة بثلاثة إلى أربعة ملليلتر من التربسين EDTA لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية للهضم الكيميائي. بعد ذلك ، اغسله ثلاث مرات بمحلول ملح هانك المتوازن الخالي من أيون الكالسيوم و 0.1٪ جلوكوز. قم بفصل الأنسجة ميكانيكيا 10 مرات عن طريق السحب لأعلى ولأسفل باستخدام طرف سعة 1000 ميكرولتر في DMEM بالإضافة إلى 10٪ FCS.
أجهزة الطرد المركزي المجانسة عند 100 غرام لمدة دقيقة واحدة ، وجمع المادة الطافية ، واستكمال الحجم المتبقي في 1،000 ميكرولتر. قم بتعليق الخلية على أطباق زراعة الخلايا بكثافة 520 خلية لكل ملليمتر مربع مع ملليلتر من DMEM يحتوي على 10٪ FCS و 1٪ بنسلين ستربتومايسين و 1٪ من مادة مضافة للأحماض الأمينية الأساسية. احتضان عند 37 درجة مئوية في بيئة رطبة مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعتين.
للسماح بتمايز الخلايا العصبية ، قم بتغيير الوسط للحصول على وسط عصبي قاعدي خال من المصل باستخدام مكمل خال من المصل. حافظ على الثقافات عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون حتى العلاج. للصلب ، امزج اثنين من قليل النيوكليوتيدات أحادي الشريط مع تسلسلات تكميلية بكميات مولية متساوية.
يسخن عند 95 درجة مئوية لمدة دقيقتين. نقل العينات من كتلة الحرارة وتخفيف المنتج الناتج إلى تركيز نهائي من 0.5 ميكرومولار. لاستنساخ shRNA إدراج في ناقلات pLKO عدسية.
3G ، هضم ميكروغرام واحد من الناقل مع إنزيمات تقييد EcoR1 و PAC1. امزج بلطف عن طريق سحب المزيج واحتضانه لمدة ثلاث إلى أربع ساعات عند 37 درجة مئوية. للربط ، امزج المتجه المهضوم وأدخله في نسبة مولية 3: 1.
احتضانها مع T4 ligase و ligase buffer بين عشية وضحاها عند 16 درجة مئوية. بعد ذلك ، امزج المكون E.coli مع الحجم الكلي لتفاعل الربط وقم بتبريده على الجليد لمدة 15 دقيقة. ضعه في حمام 42 درجة مئوية لمدة دقيقتين ثم برد على الثلج مرة أخرى لمدة 15 دقيقة.
انقل الحجم الكلي المعرض لصدمة حرارية إلى أنبوب سعة 15 ملليلتر وأكمل الحجم إلى 1،000 ميكرولتر باستخدام Luria-Bertani ، أو وسط سائل L-B. هز البكتيريا لمدة 90 دقيقة من 37 درجة مئوية في شاكر مداري عند حوالي 330 دورة في الدقيقة. أجهزة الطرد المركزي التي اجتمعت 5،000 G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.
تخلص من 900 ميكرولتر من المادة الطافية واستخدم المادة الطافية المتبقية لإعادة تعليق الحبيبات. انشر معلق البكتيريا بالتساوي على صفيحة أمبيسلين L-B صلبة واحتضانها لمدة 37 درجة مئوية طوال الليل. اختر مستعمرة واحدة لنقلها إلى أنبوب سعة 15 ملليلتر به 10 ملليلتر من الوسط السائل L-B والأمبيسلين.
هز البكتيريا عند 37 درجة مئوية عند حوالي 330 دورة في الدقيقة وطرد مركزي للمزرعة لتكوير البكتيريا عند 5000 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد التخلص من المادة الطافية ، حافظ على الحبيبات البكتيرية عند 20 درجة مئوية تحت الصفر. قبل 24 ساعة من النقل ، قم بزرع 1 إلى 5 ملايين خلية HEK-293 في أطباق استزراع 100 ملم.
مزيج 14 ميكروغرام من pKLO. ناقل 3G مع إدراج محدد ، 10.5 ميكروغرام من التعبئة psPAX البلازميد ، و 3.5 ميكروغرام من مغلف البلازميد pMD2. G.تمييع 45 ميكرولتر من كاشف نقل البلازميد في 700 ميكرولتر من وسط المصل المنخفض واحتضانه لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.
ثم يمزج خليط الحمض النووي مع كاشف نقل البلازميد المخفف ، ويخلط بلطف ، ويحتضن لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. قم بتغيير وسط طبق الثقافة لخلايا HEK-293 بوسط جديد بعد النقل وأضف الحجم الكامل لمحلول الحمض النووي قطرة قطرة. قم بهز الطبق برفق واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 48 إلى 72 ساعة للسماح ل shRNAs بالوصول إلى نقلها الأمثل.
جمع الوسط مع lentivirus وتخزينها في أربع درجات مئوية. قم بترشيح المادة الطافية الفيروسية بغشاء نايلون 0.45 ميكرومتر و aliquot ملليمتر واحد من التدفق. أجهزة الطرد المركزي في 17،000 غرام لمدة أربع ساعات.
تخلص من المادة الطافية وحافظ على الحبيبات. اترك الحبيبات غير المرئية تجف ، وبمجرد تجفيفها ، قم بتخزينها في درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر. تصيب مزارع الخلايا العصبية القشرية الأولية بقليل نيوكليوتيدات shRNA محددة ، وتستهدف UTRs ثلاثية الرؤوس إما من الكالسينورين A-alpha أو CHOP وتحتضنها عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون ليوم واحد.
بعد ذلك ، أضف محلول مرق GM2 إلى وسط طبق الاستزراع بتركيز نهائي يبلغ 2 ميكرومولار واحتضانه عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 16 و 24 و 48 ساعة. ثبت الخلايا بنسبة 4٪ بارافورمالدهيد وسكروز 120 مليمولار في برنامج تلفزيوني لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية ثم اغسلها باستخدام برنامج تلفزيوني. أضف محلول النفاذية لمدة خمس دقائق واغسله باستخدام برنامج تلفزيوني.
استخدم 5٪ BSA مخففا في برنامج تلفزيوني لمدة 45 دقيقة للسماح بالحجب. بعد ذلك ، احتضن الجسم المضاد ل MAP2 عند أربع درجات مئوية طوال الليل. بعد غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني في نهاية وقت الحضانة ، احتضان مع جسم مضاد ثانوي لمدة ساعة واحدة.
قم بتركيب النظارات بعد غسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني. بعد الحصول على الصور باستخدام مجهر مقلوب epifluorescence ، قم بتحميل الصورة للحصول على ImageJ وطرح الخلفية بالنقر فوق عملية متبوعة بطرح الخلفية. انقر فوق الصورة ، ضبط ، عتبة لضبط الحد الأدنى من القيم ، مما يسمح بتمييز المسار وبعض التتبعات.
احذف somas باستخدام التحديد اليدوي. حدد آثار وانقر على تحرير ، تحديد ، إنشاء تحديد. احصل على عائد الاستثمار من خلال النقر على مفاتيح التحكم و T للاختيار والحفاظ عليه.
افتح الصورة الأصلية. انقر فوق لوحة ROI Manager وحدد بداية عائد الاستثمار. ثم انقر على الصورة الأصلية.
بمجرد تتبع عائد الاستثمار على الصورة ، اضغط على مفاتيح التحكم ومفاتيح M لمعالجة التحليل الإحصائي. جرت محاولة هنا للتحقق مما إذا كان إسكات مكونات المصب 2pERK يؤثر على المرحلة الانتقالية لاستجابة البروتين غير المطوية في نموذج خلية الإجهاد ER. تم إسكات جين الكالسينورين A-alpha وجين CHOP بواسطة تسلسلين محددين من shRNA في مزرعة الخلايا العصبية الأولية ليوم واحد.
يتم تحليل التعبير عن طريق النشاف الغربي. لوحظ تثبيط واضح للكالسينورين A-alpha بوساطة الإجهاد ER وزيادة مستوى CHOP في خلايا ضربة قاضية. تم فحص الارتباط المحتمل لإجهاد ER الناجم عن تراكم GM2 مع التنكس العصبي عن طريق إجراء تلطيخ منااعي MAP2 للمزارع العصبية الأولية.
يزداد ضمور الخلايا العصبية بشكل ملحوظ بعد إحداث إجهاد ER عن طريق حضانة GM2 في 16 إلى 48 ساعة. إسكات تعبير الكالسينورين A-alpha يعزز بشكل كبير ضمور الخلايا العصبية ، خاصة في 16 ساعة من تراكم GM2 بالنسبة للمجموعات غير المعالجة GM2. وهكذا ، سرعت ضربة قاضية الكالسينورين A-alpha عملية التنكس في الخلايا العصبية ، مما يؤكد التأثير المؤيد للبقاء على قيد الحياة للكالسينورين خلال المرحلة المبكرة من استجابة البروتين التي تكشفت.
وعلى العكس من ذلك، أدت ضربة قاضية لمستشفى فيلادلفيا للأطفال إلى تضاؤل ضمور الخلايا العصبية بشكل كبير مقارنة بالضوابط بدقة في غضون 16 إلى 24 ساعة. بروتوكول الخلية مع زراعة الخلايا الأولية المناسبة والحصول على 90 أو أعلى من الخلايا المصابة بفيروس lentivirus المعني. وبما أن فقدان المحور العصبي الطرفي هو الخطوة الأولى التي نضعها في عمليتنا، فمن الممكن أيضا تقييم ذلك عن طريق إجراء الفحص.
تسمح هذه التقنية لمجموعتنا والآخرين بتقييم بعض الجزيئات كأدوات علاجية محتملة.
