גישה זו עשויה לשמש במודלים של מערכת התא של לחץ רשתית אנדופלסמי על ידי מניפולציה של הביטוי המולקולרי של רכיבי זוג במורד הזרם. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא להסיר את ההשפעה של איתות זוגי על ידי הדמיה ומדידה של מסלולים עצביים. שיטה זו יכולה לתרום להבנת הבסיס המולקולרי של המעבר בין שלבים חריפים וכרוניים של לחץ בחדר מיון במודלים שונים של מחלות נוירודגנרטיביות מלבד גנגליוזידוזיס GM2 כדי להתחיל, לנתח את הרקמה תחת זכוכית מגדלת 20X עם שני מלקחיים דקים מספר חמש, המפרידים את קליפת המוח הקדמית מן קרומי המוח.
העבירו את קליפת המוח הקדמית לצינור חרוטי של 15 מיליליטר ודגרו על הרקמה עם שלושה עד ארבעה מיליליטר של טריפסין EDTA למשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לעיכול כימי. לאחר מכן, שטפו אותו שלוש פעמים עם תמיסת מלח מאוזנת של Hank ללא סידן מגנזיום וללא יונים ו-0.1% גלוקוז. נתק מכנית את הרקמה 10 פעמים על ידי פיפטציה למעלה ולמטה באמצעות קצה 1, 000 מיקרוליטר ב- DMEM בתוספת 10% FCS.
צנטריפוגה הומוגנט ב 100 גרם במשך דקה אחת, לאסוף את supernatant, ולהשלים את הנפח הנותר ב 1, 000 מיקרוליטר. צלחת את תרחיף התא על צלחות תרבית תאים בצפיפות של 520 תאים למילימטר מרובע עם שני מיליליטר של DMEM המכיל 10% FCS, 1% פניצילין סטרפטומיצין, ו 1% של תוסף חומצת אמינו חיונית. יש לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בסביבה לחה עם 5% פחמן דו חמצני למשך שעתיים.
כדי לאפשר התמיינות של תאים עצביים, החליפו את המדיום למדיום נוירו-בסיסי ללא סרום בתוסף ללא סרום. שמרו על תרביות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני עד לטיפול. לחישול, ערבבו שני אוליגונוקלאוטידים חד-גדיליים עם רצפים משלימים בכמויות טוחנות שוות.
מחממים בחום של 95 מעלות למשך שתי דקות. מעבירים את הדגימות מבלוק החום ומדללים את המוצר המתקבל לריכוז סופי של 0.5 מיקרומולרית. כדי לשכפל את shRNA להכניס לתוך pLKO וקטור lentiviral.
3G, לעכל מיקרוגרם אחד של הווקטור עם אנזימי הגבלה EcoR1 ו-PAC1. מערבבים בעדינות על ידי פיפטינג ודגרים על התגובה במשך שלוש עד ארבע שעות בחום של 37 מעלות צלזיוס. לקשירה, מערבבים את הווקטור המעוכל ומכניסים אותו ביחס מולארי של 3:1.
לדגור אותו עם T4 ליגאז ו ligase buffer במשך הלילה ב 16 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, ערבבו את רכיב E.coli עם הנפח הכולל של תגובת הקשירה וצננו אותו על קרח במשך 15 דקות. הכניסו אותו לאמבטיה של 42 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות ואז צננו אותו שוב על קרח למשך 15 דקות.
העבר את הנפח הכולל הנתון להלם חום לצינור של 15 מיליליטר והשלם את הנפח ל -1, 000 מיקרוליטר עם Luria-Bertani, או L-B מדיום נוזלי. נערו את החיידקים במשך 90 דקות של 37 מעלות צלזיוס בשייקר מסלולי, בערך 330 סל"ד. צנטריפוגה שפגשה 5, 000 גרם במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.
השליכו 900 מיקרוליטר של הסופרנאטנט והשתמשו בסופרנאטנט שנותר כדי להשהות מחדש את הכדור. מפזרים את תרחיף החיידקים באופן שווה על צלחת אמפיצילין L-B מוצקה ודגרים במשך 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. בחר מושבה אחת להעביר לתוך צינור 15 מיליליטר עם 10 מיליליטר של L-B נוזל בינוני אמפיצילין.
נערו את החיידקים ב 37 מעלות צלזיוס בערך 330 סל"ד וצנטריפוגה את התרבית כדי לגלול את החיידקים ב 5, 000 גרם במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר השלכת הסופרנטנט, משמרים את כדורית החיידקים במינוס 20 מעלות צלזיוס. 24 שעות לפני ההעברה, זרעו 1 עד 5 מיליון תאי HEK-293 לתוך צלחות תרבית של 100 מילימטר.
מערבבים 14 מיקרוגרם של pKLO. וקטור דור 3 עם תוספת ספציפית, 10.5 מיקרוגרם של פלסמיד אריזה psPAX, ו 3.5 מיקרוגרם של פלסמיד מעטפה pMD2. G.לדלל 45 מיקרוליטר של מגיב טרנספקציה פלסמיד ב 700 מיקרוליטר של מדיום סרום מופחת לדגור במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן ערבבו את תערובת הדנ"א עם מגיב הטרנספקציה של פלסמיד מדולל, ערבבו בעדינות ודגרו במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. שנה את המדיום של צלחת התרבית של תאי HEK-293 עם מדיום טרי לאחר transfection ולהוסיף את כל נפח תמיסת ה- DNA טיפה אחר טיפה. נענעו את התבשיל בעדינות ודגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני למשך 48 עד 72 שעות כדי לאפשר ל-shRNA להגיע להתמרה האופטימלית שלהם.
לאסוף את המדיום עם lentivirus ולאחסן בארבע מעלות צלזיוס. מסננים את הסופרנאטנט הנגיפי עם קרום ניילון באורך 0.45 מיקרומטר ויוצרים מילימטר אחד מהזרימה. צנטריפוגה ב 17, 000 G במשך ארבע שעות.
השליכו את הסופרנאטנט ושמרו את הכדור. הניחו לגלולה הבלתי נראית להתייבש, ולאחר הייבוש, אחסנו בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס. הדביקו את תרביות תאי העצב הראשוניים בקליפת המוח באוליגונוקלאוטידים ספציפיים של shRNA, תוך התמקדות בשלושת ה-UTR הראשוניים של קלצינוירין A-אלפא או CHOP ודגרו עליהם בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני למשך יום אחד.
לאחר מכן, הוסף תמיסת מלאי GM2 למדיום של צלחת התרבית בריכוז סופי של שני מיקרומולרים ודגר ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני במשך 16, 24, ו 48 שעות. תקן את התאים עם 4% paraformaldehyde ו 120-millimolar סוכרוז ב PBS במשך 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ולאחר מכן לשטוף אותם עם PBS. מוסיפים תמיסת חלחול למשך חמש דקות ושוטפים עם PBS.
השתמש 5% BSA מדולל PBS במשך 45 דקות כדי לאפשר חסימה. לאחר מכן, לדגור עם נוגדן אנטי MAP2 בארבע מעלות צלזיוס במשך הלילה. לאחר שטיפת התאים פעמיים עם PBS בסוף זמן הדגירה, לדגור עם נוגדן משני במשך שעה אחת.
הרכיבו את הכוסות לאחר שטיפת התאים עם PBS. לאחר קבלת התמונות במיקרוסקופ הפוך אפיפלואורסצנטי, טען את התמונה כדי לקבל ImageJ והחסר את הרקע על ידי לחיצה על תהליך ואחריו החסר רקע. לחץ על תמונה, התאמה, סף כדי להתאים ערכי מינימום, ומאפשר להבחין בין נתיב וכמה עקיבה.
מחק סומות באמצעות הבחירה ביד חופשית. בחר עקבות ולחץ על ערוך, בחירה, צור בחירה. קבל את החזר ההשקעה על ידי לחיצה על מקשי הבקרה וה- T של הבחירה ושמור עליה.
פתח את התמונה המקורית. לחץ על לוח ROI Manager ובחר את החזר ההשקעה המתחיל. לאחר מכן לחץ על התמונה המקורית.
לאחר מעקב אחר החזר ההשקעה על התמונה, לחץ על המקשים control ו- M כדי לעבד את הניתוח הסטטיסטי. נעשה כאן ניסיון לבדוק האם השתקת רכיבים 2pERK במורד הזרם משפיעה על שלב המעבר של תגובת החלבון שנפרש במודל תאי הלחץ של ER. הגן calcineurin A-alpha וגן CHOP הושתקו על ידי שני רצפי shRNA ספציפיים בתרבית תא נוירון ראשונית ליום אחד.
הביטוי מנותח על ידי כתם מערבי. עיכוב ברור נצפה של עלייה ברמת הקלצינוירין A-alpha ו- CHOP בתיווך מתח בתאי הדחקה. הקשר האפשרי של לחץ ER הנגרם על ידי הצטברות GM2 עם ניוון עצבי נבדק על ידי ביצוע MAP2 immunostaining של תרביות עצביות ראשוניות.
ניוון עצבים עולה באופן משמעותי לאחר גרימת לחץ בחדר מיון על ידי דגירה של GM2 לאחר 16 עד 48 שעות. השתקה של ביטוי קלצינוירין A-אלפא מגבירה באופן משמעותי את ניוון הנוירוטים, במיוחד לאחר 16 שעות של הצטברות GM2 ביחס לקבוצות GM2 שלא טופלו. לפיכך, calcineurin A-alpha knockdown האיץ את תהליך הניוון בנוירונים, ואישש את ההשפעה הפרו-הישרדותית של calcineurin במהלך השלב המוקדם של תגובת חלבון פתוח.
לעומת זאת, הפלה של CHOP הביאה לירידה משמעותית בניוון הנוריט ביחס לבקרות בדיוק לאחר 16 עד 24 שעות. פרוטוקול התא עם תרבית התאים הראשונית המתאימה וקבלת 90 או אחוז גבוה יותר של תאים נגועים בלנטיוירוס המתאים. מכיוון שאובדן האקסון הטרמינלי העצבי הוא הצעד הראשון שאנו מציגים בתהליך שלנו, ניתן גם להעריך זאת על ידי ביצוע בדיקה.
טכניקה זו מאפשרת לקבוצה שלנו ולאחרים להעריך מולקולות מסוימות ככלים טיפוליים פוטנציאליים.
