このアプローチは、下流のペア成分の分子発現を操作することにより、小胞体ストレスの細胞系モデルに使用することができます。この技術の主な利点は、神経経路の視覚化と測定によってペアのシグナル伝達の影響を取り除くことです。この方法は、GM2ガングリオシドーシス以外の多様な神経変性疾患モデルにおけるERストレスの急性期と慢性期の移行の分子基盤の理解に貢献できます。 まず、2つの細い先端番号5鉗子を使用して20倍の虫眼鏡の下で組織を解剖し、前頭皮質を髄膜から分離します。
前頭皮質を15ミリリットルの円錐管に移し、化学消化のために37°Cで15分間、3〜4ミリリットルのトリプシンEDTAで組織をインキュベートします。その後、カルシウムマグネシウムイオンフリーのハンクス平衡塩溶液と0.1%グルコースで3回洗浄します。DMEMと10%FCSの1, 000マイクロリットルのチップを使用して上下にピペッティングすることにより、組織を10回機械的に解離します。
ホモジネートを100 Gで1分間遠心分離し、上清を集めて、残りの容量を1, 000マイクロリットルで完成させます。細胞懸濁液を、10%FCS、1%ペニシリンストレプトマイシン、および1%の必須アミノ酸添加剤を含む2ミリリットルのDMEMを使用して、1平方ミリメートルあたり520細胞の密度で細胞培養皿にプレートします。5%二酸化炭素を含む加湿環境で摂氏37度で2時間インキュベートします。
神経細胞の分化を可能にするには、無血清サプリメントを含む無血清神経基礎培地に培地を変更します。処理するまで、培養物を摂氏37度に保ち、5%の二酸化炭素を使用します。アニーリングでは、相補配列を持つ2つの一本鎖オリゴヌクレオチドを等モル量で混合します。
摂氏95度で2分間加熱します。ヒートブロックからサンプルを移し、得られた生成物を最終濃度0.5マイクロモルに希釈します。shRNAインサートをレンチウイルスベクターpLKOにクローニングする。
3G、1マイクログラムのベクターをEcoR1およびPAC1制限酵素で消化する。ピペッティングで穏やかに混合し、摂氏37度で3〜4時間反応をインキュベートします。ライゲーションの場合は、消化したベクターを混合し、3:1のモル比で挿入します。
T4リガーゼとリガーゼバッファーと一緒に摂氏16度で一晩インキュベートします。次に、成分大腸菌をライゲーション反応の全量と混合し、氷上で15分間冷却する。摂氏42度のお風呂に2分間入れてから、再び氷の上で15分間冷やします。
ヒートショックを受けた全量を15ミリリットルのチューブに移し、Luria-BertaniまたはL-B液体培地で1, 000マイクロリットルまで容量を完成させます。約330RPMのオービタルシェーカーで摂氏37度で90分間バクテリアを振とうします。摂氏4度で5分間5, 000 Gを満たした遠心分離機。
900マイクロリットルの上清を廃棄し、残りの上清を使用してペレットを再懸濁します。細菌懸濁液を固体アンピシリンL-Bプレート上に均等に広げ、摂氏37度で一晩インキュベートします。単一のコロニーを選択して、10ミリリットルのL-B液体培地とアンピシリンを入れた15ミリリットルのチューブに移します。
約330 RPMで摂氏37度で細菌を振盪し、培養物を遠心分離して、摂氏4度で5分間5, 000 Gで細菌をペレット化します。上清を廃棄した後、摂氏マイナス20度で細菌ペレットを保存します。トランスフェクションの24時間前に、1〜500万個のHEK-293細胞を100ミリメートルの培養皿に播種します。
14マイクログラムのpKLOを混合します。特異的インサート、10.5マイクログラムのパッキングプラスミドpsPAX、および3.5マイクログラムのエンベローププラスミドpMD2を有する3Gベクター。G.45マイクロリットルのプラスミドトランスフェクション試薬を700マイクロリットルの還元血清培地で希釈し、室温で5分間インキュベートします。
次に、DNA混合物を希釈プラスミドトランスフェクション試薬と混合し、穏やかに混合し、室温で20分間インキュベートします。トランスフェクション後にHEK-293細胞の培養皿の培地を新鮮な培地で交換し、DNA溶液の全量を一滴ずつ加えます。皿を穏やかに揺り動かし、細胞を摂氏37度、5%二酸化炭素で48〜72時間インキュベートして、shRNAが最適な形質導入に到達できるようにします。
レンチウイルスを含む培地を回収し、摂氏4度で保存します。ウイルス上清を0.45マイクロメートルのナイロンメンブレンでろ過し、1ミリメートルのフロースルーを分注します。17, 000 Gで4時間遠心分離します。
上清を捨ててペレットを保存してください。目に見えないペレットを乾燥させ、乾燥したらマイナス80°Cで保管します。初代皮質ニューロン培養物を特定のshRNAオリゴヌクレオチドで感染させ、カルシニューリンA-αまたはCHOPのいずれかの3つの主要なUTRを標的とし、摂氏37度で5%の二酸化炭素で1日間インキュベートします。
その後、GM2ストック溶液を最終濃度2マイクロモルで培養皿の培地に加え、摂氏37度で5%二酸化炭素で16時間、24時間、48時間インキュベートします。細胞を4%パラホルムアルデヒドと120ミリモルスクロースでPBSで摂氏37度で20分間固定し、PBSで洗浄します。透過処理液を5分間加え、PBSで洗浄する。
ブロッキングを可能にするために、PBSで希釈した5%BSAを45分間使用します。その後、抗MAP2抗体とともに摂氏4度で一晩インキュベートします。インキュベーション時間の最後に細胞をPBSで2回洗浄した後、二次抗体とともに1時間インキュベートする。
細胞をPBSで洗浄した後、メガネを取り付けます。落射蛍光倒立顕微鏡で画像を取得した後、画像をロードしてImageJを取得し、[プロセス]、[背景の減算]の順にクリックして背景を減算します。画像、調整、しきい値をクリックして最小値を調整し、パスと一部のトレースを区別できるようにします。
フリーハンド選択を使用してソーマを削除します。[トレース] を選択し、[編集]、[選択]、[選択の作成] をクリックします。選択範囲のコントロールキーとTキーをクリックしてROIを取得し、それを保存します。
元の画像を開きます。ROIマネージャーパネルをクリックし、開始ROIを選択します。次に、元の画像をクリックします。
ROIが画像にトレースされたら、CtrlキーとMキーを押して統計分析を処理します。ここでは、2pERK下流成分のサイレンシングが、ERストレス細胞モデルにおける折り畳まれていないタンパク質応答の移行期に影響を与えるかどうかを確認する試みが行われました。カルシニューリンA-α遺伝子およびCHOP遺伝子を、初代ニューロン細胞培養において2つの特定のshRNA配列によって1日間サイレンシングした。
発現はウエスタンブロッティングによって分析される。ノックダウン細胞におけるERストレス媒介カルシニューリンA-αおよびCHOPレベルの上昇の明確な阻害が観察されます。GM2蓄積誘発性小胞体ストレスと神経変性との関連の可能性を、初代神経培養物のMAP2免疫染色を行うことにより検討した。
神経突起萎縮は、16〜48時間でGM2のインキュベーションによって小胞体ストレスを誘発した後に有意に増加します。カルシニューリンA-α発現のサイレンシングは、特にGM2未治療群と比較してGM2蓄積の16時間で神経突起萎縮を有意に増強する。したがって、カルシニューリンA-αノックダウンはニューロンの変性プロセスを加速し、折り畳まれていないタンパク質応答の初期段階におけるカルシニューリンの生存促進効果を裏付けています。
逆に、CHOPノックダウンは、正確に16〜24時間で対照と比較して神経突起萎縮を有意に減少させました。適切な初代細胞培養による細胞プロトコルにより、それぞれのレンチウイルスに感染した細胞の90以上の割合を得る。神経終末軸索の喪失は、私たちのプロセスでレイアウトする最初のステップであるため、アッセイを実行することによってこれを評価することもできます。
この技術により、私たちのグループや他のグループは、潜在的な治療ツールとしていくつかの分子を評価することができます。
