이 접근법은 다운스트림 쌍 성분의 분자 발현을 조작하여 소포체 스트레스의 세포 시스템 모델에 사용될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 신경 경로의 시각화 및 측정을 통해 쌍을 이루는 신호의 영향을 제거하는 것입니다. 이 방법은 GM2 강글리오시드증 외에 다양한 신경퇴행성 질환 모델에서 ER 스트레스의 급성 단계와 만성 단계 사이의 전환에 대한 분자적 기초를 이해하는 데 기여할 수 있습니다. 시작하려면 2개의 미세 팁 5번 집게를 사용하여 20X 돋보기 아래에서 조직을 해부하여 전두엽 피질과 수막을 분리합니다.
전두엽 피질을 15 밀리리터의 원추형 튜브로 옮기고 화학적 소화를 위해 섭씨 37도에서 15 분 동안 3-4 밀리리터의 트립신 EDTA로 조직을 배양합니다. 그 후 칼슘, 마그네슘, 이온이 없는 행크의 균형 잡힌 소금 용액과 0.1% 포도당으로 세 번 씻습니다. DMEM에 10% FCS를 더한 1, 000 마이크로리터 팁을 사용하여 위아래로 피펫팅하여 조직을 기계적으로 10회 해리합니다.
균질액을 100 G에서 1 분 동안 원심 분리하고, 상청액을 수집하고, 1, 000 마이크로 리터의 나머지 부피를 완성한다. 10% FCS, 1% 페니실린 스트렙토마이신 및 1%의 필수 아미노산 첨가제를 함유한 DMEM 2밀리리터를 사용하여 제곱밀리미터당 520개 세포 밀도로 세포 배양 접시에 세포 현탁액을 플레이트합니다. 섭씨 37도에서 5%이산화탄소가 함유된 가습 환경에서 2시간 동안 배양합니다.
신경 세포 분화를 허용하려면 무혈청 보충제를 사용하여 배지를 무혈청 neurobasal 배지로 변경하십시오. 처리 될 때까지 5 % 이산화탄소로 섭씨 37도에서 배양 물을 유지하십시오. 어닐링을 위해, 두 개의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 동일한 몰량의 상보적 서열과 혼합합니다.
섭씨 95도에서 2 분 동안 가열합니다. 열 블록에서 샘플을 옮기고 생성 된 생성물을 0.5- 마이크로 몰의 최종 농도로 희석한다. shRNA 삽입물을 렌티바이러스 벡터 pLKO에 클로닝한다.
3G, EcoR1 및 PAC1 제한 효소로 벡터의 1마이크로그램을 분해합니다. 피펫팅으로 부드럽게 혼합하고 섭씨 37도에서 3-4시간 동안 반응을 배양합니다. 결찰을 위해 분해된 벡터를 혼합하고 3:1의 몰비로 삽입합니다.
섭씨 16도에서 밤새 T4 리가아제 및 리가아제 완충액과 함께 배양합니다. 다음으로, 성분 E.coli를 결찰 반응의 총량과 혼합하고 15 분 동안 얼음에서 식힌다. 섭씨 42도의 욕조에 2분 동안 담갔다가 다시 얼음에 15분 동안 식힙니다.
열 충격을받는 총 부피를 15 밀리리터 튜브로 옮기고 Luria-Bertani 또는 L-B 액체 배지로 부피를 1, 000 마이크로 리터로 완성하십시오. 약 330RPM의 궤도 셰이커에서 섭씨 37도의 90분 동안 박테리아를 흔들어 줍니다. 섭씨 4도에서 5 분 동안 5, 000 G을 만난 원심 분리기.
900 마이크로 리터의 상청액을 버리고 나머지 상청액을 사용하여 펠릿을 재현탁하십시오. 박테리아 현탁액을 고체 암피실린 LB 플레이트에 골고루 펴고 밤새 섭씨 37도 동안 배양합니다. 단일 콜로니를 선택하여 10 밀리리터의 L-B 액체 배지와 암피실린이 들어있는 15 밀리리터 튜브로 옮깁니다.
박테리아를 섭씨 37도에서 약 330RPM으로 흔들고 배양액을 원심분리하여 섭씨 4도에서 5분 동안 5, 000G에서 박테리아를 펠렛화합니다. 상층액을 버린 후 박테리아 펠릿을 섭씨 영하 20도에서 보존하십시오. 형질감염 24시간 전에, 1 내지 500만 HEK-293 세포를 100 밀리미터 배양 접시에 시딩한다.
14마이크로그램의 pKLO를 섞는다. 특정 삽입물, 10.5마이크로그램의 패킹 플라스미드 psPAX 및 3.5마이크로그램의 외피 플라스미드 pMD2가 있는 3G 벡터. G. 45 마이크로리터의 플라스미드 형질주입 시약을 700 마이크로리터의 환원 혈청 배지에 희석하고 실온에서 5분 동안 배양한다.
그런 다음 DNA 혼합물을 희석된 플라스미드 형질주입 시약과 결합하고 부드럽게 혼합한 다음 실온에서 20분 동안 배양합니다. 형질전환 후 HEK-293 세포의 배양 접시의 배지를 새로운 배지로 교체하고 DNA 용액의 전체 부피를 한 방울씩 추가합니다. 접시를 부드럽게 흔들고 섭씨 37도, 5% 이산화탄소에서 48-72시간 동안 세포를 배양하여 shRNA가 최적의 형질도입에 도달할 수 있도록 합니다.
렌티 바이러스로 배지를 수집하고 섭씨 4도에서 보관하십시오. 바이러스 상청액을 0.45마이크로미터 나일론 멤브레인으로 여과하고 1mm의 분취액을 통과합니다. 17, 000 G에서 4 시간 동안 원심 분리기.
상청액을 버리고 펠릿을 보존하십시오. 보이지 않는 펠릿을 건조시키고 건조되면 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 칼시뉴린 A-알파 또는 CHOP의 3프라임 UTR을 표적으로 하는 특정 shRNA 올리고뉴클레오티드로 일차 피질 뉴런 배양을 감염시키고 섭씨 37도에서 하루 동안 5% 이산화탄소로 배양합니다.
그 후, GM2 원액을 2 마이크로 몰의 최종 농도로 배양 접시의 배지에 첨가하고 섭씨 37도에서 5 % 이산화탄소로 16, 24 및 48 시간 동안 배양합니다. 섭씨 37도에서 20분 동안 PBS에 4% 파라포름알데히드와 120밀리몰 자당으로 세포를 고정한 다음 PBS로 세척합니다. 5분 동안 투과화 용액을 첨가하고 PBS로 세척한다.
블로킹을 허용하기 위해 PBS에 희석된 5% BSA를 45분 동안 사용하십시오. 그런 다음 섭씨 4도에서 항-MAP2 항체와 함께 하룻밤 동안 배양합니다. 배양 종료 시점에 PBS로 세포를 2회 세척한 후, 1시간 동안 2차 항체와 함께 배양한다.
PBS로 세포를 세척한 후 안경을 장착합니다. 에피형광 도립 현미경으로 이미지를 얻은 후 사진을 로드하여 ImageJ를 얻고 프로세스를 클릭한 다음 배경 빼기를 클릭하여 배경을 뺍니다. Image(이미지), Adjust(조정), Threshold(임계값)를 클릭하여 최소값을 조정하여 경로와 일부 추적을 구별할 수 있습니다.
자유형 선택을 사용하여 somas를 삭제합니다. Traces(추적)를 선택하고 Edit(편집), Selection(선택), Create Selection(선택 만들기)을 클릭합니다. 선택 항목의 컨트롤 및 T 키를 클릭하여 ROI를 얻고 보존하십시오.
원본 이미지를 엽니다. ROI 관리자 패널을 클릭하고 시작 ROI를 선택합니다. 그런 다음 원본 이미지를 클릭합니다.
ROI가 이미지를 추적하면 control 및 M 키를 눌러 통계 분석을 처리합니다. 여기에서 2pERK 다운스트림 구성 요소를 침묵시키는 것이 ER 스트레스 세포 모델에서 풀린 단백질 반응의 전이 단계에 영향을 미치는지 확인하려고 시도했습니다. 칼시뉴린 A-알파 유전자 및 CHOP 유전자는 1차 뉴런 세포 배양물에서 2개의 특이적 shRNA 서열에 의해 하루 동안 침묵시켰다.
상기 발현은 웨스턴 블로팅에 의해 분석된다. 녹다운 세포에서 ER 스트레스 매개 칼시뉴린 A-알파 및 CHOP 수준 증가에 대한 명확한 억제가 관찰됩니다. GM2 축적 유도 ER 스트레스와 신경 변성의 가능한 연관성은 1차 신경 배양의 MAP2 면역염색을 수행하여 조사되었습니다.
신경돌기 위축은 16 내지 48시간에 GM2의 배양에 의해 ER 스트레스를 유도한 후에 유의하게 증가한다. 칼시뉴린 A-알파 발현의 침묵은 특히 GM2 미처리 그룹에 비해 GM2 축적 16시간에서 신경돌기 위축을 크게 향상시킵니다. 따라서 칼시뉴린 A-알파 녹다운은 뉴런의 퇴화 과정을 가속화하여 풀린 단백질 반응의 초기 단계에서 칼시뉴린의 생존 촉진 효과를 확증했습니다.
반대로, CHOP 녹다운은 정확히 16시간에서 24시간에 대조군에 비해 신경돌기 위축을 현저히 감소시켰습니다. 적절한 1차 세포 배양을 통한 세포 프로토콜 및 각각의 렌티바이러스로 감염된 세포의 90% 이상을 획득한다. 신경 말단 축삭의 손실은 우리가 공정에서 제시하는 첫 번째 단계이기 때문에 분석을 수행하여 이를 평가할 수도 있습니다.
이 기술을 통해 우리 그룹과 다른 사람들은 일부 분자를 잠재적인 치료 도구로 평가할 수 있습니다.
