Bu yaklaşım, aşağı akış çifti bileşenlerinin moleküler ekspresyonunu manipüle ederek endoplazmik retikulum stresinin hücre sistemi modellerinde kullanılabilir. Bu tekniğin temel avantajı, nöral yolların görselleştirilmesi ve ölçülmesiyle eşleştirilmiş sinyallemenin etkisini ortadan kaldırmaktır. Bu yöntem, GM2 gangliosidozun yanı sıra çeşitli nörodejeneratif hastalık modellerinde ER stresinin akut ve kronik fazları arasındaki geçişin moleküler temelini anlamaya katkıda bulunabilir Başlamak için, dokuyu 20X büyüteç altında iki ince uçlu beş numaralı forseps ile diseke edin ve frontal korteksi meninkslerden ayırın.
Frontal korteksi 15 mililitrelik bir konik tüpe aktarın ve kimyasal sindirim için dokuyu 37 santigrat derecede 15 dakika boyunca üç ila dört mililitre tripsin EDTA ile inkübe edin. Bundan sonra, kalsiyum magnezyum iyonsuz Hank'in dengeli tuz çözeltisi ve% 0.1 glikoz ile üç kez yıkayın. DMEM'de 1.000 mikrolitrelik bir uç artı %10 FCS kullanarak yukarı ve aşağı pipetleyerek, dokuyu 10 kez mekanik olarak ayrıştırın.
Homojenatı bir dakika boyunca 100 G'de santrifüj edin, süpernatanı toplayın ve kalan hacmi 1.000 mikrolitrede tamamlayın. Hücre kültürü tabaklarındaki hücre süspansiyonunu,% 10 FCS,% 1 penisilin streptomisin ve% 1 esansiyel amino asit katkı maddesi içeren iki mililitre DMEM ile milimetre kare başına 520 hücre yoğunluğunda plakalayın. İki saat boyunca% 5 karbondioksit ile nemlendirilmiş bir ortamda 37 santigrat derecede inkübe edin.
Nöral hücre farklılaşmasına izin vermek için, serumsuz bir nörobazal ortamın ortamını serumsuz takviye ile değiştirin. Kültürleri tedaviye kadar% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede tutun. Tavlama için, iki tek sarmallı oligonükleotidi eşit molar miktarlarda tamamlayıcı dizilerle karıştırın.
İki dakika boyunca 95 santigrat derecede ısıtın. Numuneleri ısı bloğundan aktarın ve elde edilen ürünü 0.5 mikromolarlık bir nihai konsantrasyona kadar seyreltin. ShRNA ekini lentiviral vektör pLKO'ya klonlamak için.
3G, vektörün bir mikrogramını EcoR1 ve PAC1 kısıtlama enzimleri ile sindirir. Pipetleyerek hafifçe karıştırın ve reaksiyonu 37 santigrat derecede üç ila dört saat boyunca inkübe edin. Ligasyon için, sindirilmiş vektörü karıştırın ve 3: 1'lik bir molar oranında yerleştirin.
T4 ligaz ve ligaz tamponu ile gece boyunca 16 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, bileşen E.coli'yi toplam ligasyon reaksiyonu hacmiyle karıştırın ve 15 dakika boyunca buz üzerinde soğutun. İki dakika boyunca 42 santigrat derecelik bir banyoya koyun ve ardından 15 dakika boyunca tekrar buz üzerinde soğutun.
Isı şokuna maruz kalan toplam hacmi 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve hacmi Luria-Bertani veya L-B sıvı ortamı ile 1.000 mikrolitreye tamamlayın. Bakterileri yaklaşık 330 RPM'de yörüngesel bir çalkalayıcıda 90 dakika boyunca 37 santigrat derece çalkalayın. Dört santigrat derecede beş dakika boyunca 5.000 G ile buluşan santrifüj.
Süpernatantın 900 mikrolitresini atın ve peleti yeniden askıya almak için kalan süpernatantı kullanın. Bakteri süspansiyonunu katı bir ampisilin L-B plakası üzerine eşit olarak yayın ve gece boyunca 37 santigrat derece kuluçkaya yatırın. 10 mililitre L-B sıvı ortamı ve ampisilin içeren 15 mililitrelik bir tüpe aktarmak için tek bir koloni seçin.
Bakterileri yaklaşık 330 RPM'de 37 santigrat derecede çalkalayın ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca bakterileri 5.000 G'de peletlemek için kültürü santrifüj edin. Süpernatanı attıktan sonra, bakteriyel peleti eksi 20 santigrat derecede koruyun. Transfeksiyondan 24 saat önce, 1 ila 5 milyon HEK-293 hücresini 100 milimetrelik kültür tabaklarına tohumlayın.
14 mikrogram pKLO karıştırın. Belirli bir kesici uçlu 3G vektörü, 10.5 mikrogram ambalaj plazmidi psPAX ve 3.5 mikrogram zarf plazmidi pMD2. G.45 mikrolitre plazmid transfeksiyon reaktifini 700 mikrolitre azaltılmış serum ortamında seyreltin ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.
Daha sonra DNA karışımını seyreltilmiş plazmid transfeksiyon reaktifi ile birleştirin, yavaşça karıştırın ve oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe edin. Transfeksiyondan sonra HEK-293 hücrelerinin kültür kabının ortamını taze bir ortamla değiştirin ve DNA çözeltisinin tüm hacmini damla damla ekleyin. Çanağı nazikçe sallayın ve shRNA'ların optimum transdüksiyonlarına ulaşmalarını sağlamak için hücreleri 37 santigrat derecede,% 5 karbondioksitte 48 ila 72 saat boyunca inkübe edin.
Ortamı lentivirüs ile toplayın ve dört santigrat derecede saklayın. Viral süpernatantı 0.45 mikrometrelik naylon membran ve içinden geçen akışın bir milimetresi ile filokat yapın. Dört saat boyunca 17.000 G'de santrifüj.
Süpernatantı atın ve peleti koruyun. Görünmez peletin kurumasına izin verin ve kuruduktan sonra eksi 80 santigrat derecede saklayın. Birincil kortikal nöron kültürlerini spesifik shRNA oligonükleotidleri ile enfekte edin, kalsinörin A-alfa veya CHOP'un üç asal UTR'lerini hedef alın ve bunları bir gün boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin.
Bundan sonra, kültür kabının ortamına GM2 stok çözeltisini iki mikromolar'lık son bir konsantrasyonda ekleyin ve 16, 24 ve 48 saat boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin. PBS'de% 4 paraformaldehit ve 120 milimolar sakkaroz ile hücreleri 37 santigrat derecede 20 dakika sabitleyin ve ardından PBS ile yıkayın. Beş dakika boyunca geçirgenlik çözeltisi ekleyin ve PBS ile yıkayın.
Engellemeye izin vermek için PBS'de seyreltilmiş %5 BSA değerini 45 dakika boyunca kullanın. Daha sonra, gece boyunca dört santigrat derecede anti-MAP2 antikoru ile inkübe edin. Hücreleri kuluçka süresinin sonunda PBS ile iki kez yıkadıktan sonra, bir saat boyunca ikincil bir antikor ile inkübe edin.
Hücreleri PBS ile yıkadıktan sonra gözlükleri takın. Epifloresan ters mikroskopla görüntüleri elde ettikten sonra, ImageJ'yi elde etmek için resmi yükleyin ve İşlem'e ve ardından Arka Planı Çıkar'a tıklayarak arka planı çıkarın. Minimum değerleri ayarlamak, yolun ve bazı izlemelerin ayırt edilebilir olmasına izin vermek için Resim, Ayarla, Eşik'e tıklayın.
Serbest el seçimini kullanarak somaları silin. İzler'i seçin ve Düzenle, Seçim, Seçim Oluştur'a tıklayın. Seçimin kontrol ve T tuşlarına tıklayarak yatırım getirisini elde edin ve koruyun.
Orijinal görüntüyü açın. YG Yöneticisi paneline tıklayın ve başlangıç YG'sini seçin. Ardından orijinal resme tıklayın.
ROI görüntü üzerinde izlendikten sonra, istatistiksel analizi işlemek için control ve M tuşlarına basın. Burada, 2pERK aşağı akış bileşenlerinin susturulmasının, ER stres hücresi modelinde katlanmamış protein yanıtının geçiş aşamasını etkileyip etkilemediğini kontrol etmek için bir girişimde bulunulmuştur. Kalsinörin A-alfa geni ve CHOP geni, bir gün boyunca birincil nöron hücre kültüründe iki spesifik shRNA dizisi tarafından susturuldu.
İfade Batı lekeleme ile analiz edilir. Nakavt hücrelerinde ER stres aracılı kalsinörin A-alfa ve CHOP seviye artışının açık bir inhibisyonu gözlenmiştir. GM2 birikimine bağlı ER stresinin nöronal dejenerasyon ile olası bağlantısı, primer nöronal kültürlerin MAP2 immün boyaması yapılarak incelendi.
Nörit atrofisi, GM2'nin 16 ila 48 saatte inkübasyonu ile ER stresini indükledikten sonra önemli ölçüde artar. Kalsinörin A-alfa ekspresyonunun susturulması, özellikle GM2 tedavi edilmeyen gruplara göre 16 saatlik GM2 birikiminde nörit atrofisini önemli ölçüde arttırır. Böylece, kalsinörin A-alfa knockdown, nöronlardaki dejenerasyon sürecini hızlandırdı ve ortaya çıkan protein yanıtının erken evresinde kalsinörinin hayatta kalma yanlısı etkisini doğruladı.
Tersine, CHOP knockdown, tam olarak 16 ila 24 saat arasındaki kontrollere göre nörit atrofisinin önemli ölçüde azalmasına neden oldu. uygun birincil hücre kültürü ile hücre protokolü ve ilgili lentivirüs ile enfekte hücrelerin 90 veya daha yüksek yüzdesinin elde edilmesi. Nöral terminal akson kaybı, sürecimizde ortaya koyduğumuz ilk adım olduğundan, bunu tahlil yaparak değerlendirmek de mümkündür.
Bu teknik, grubumuzun ve diğerlerinin bazı molekülleri potansiyel terapötik araçlar olarak değerlendirmelerini sağlar.
