Dieser Ansatz kann in Zellsystemmodellen des endoplasmatischen Retikulumstresses verwendet werden, indem die molekulare Expression nachgeschalteter Paarkomponenten manipuliert wird. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, die Auswirkungen der gepaarten Signalübertragung durch die Visualisierung und Messung von Nervenbahnen zu beseitigen. Diese Methode kann dazu beitragen, die molekularen Grundlagen des Übergangs zwischen akuten und chronischen Phasen von ER-Stress in verschiedenen neurodegenerativen Krankheitsmodellen neben der GM2-Gangliosidose zu verstehen. Zu Beginn wird das Gewebe unter einer 20-fachen Lupe mit zwei feinen Pinzetten Nummer fünf präpariert, wobei der frontale Kortex von den Hirnhäuten getrennt wird.
Übertragen Sie den frontalen Kortex in einen 15-Milliliter-Konusschlauch und inkubieren Sie das Gewebe mit drei bis vier Millilitern Trypsin-EDTA für 15 Minuten bei 37 Grad Celsius für den chemischen Aufschluss. Waschen Sie es danach dreimal mit Calcium-Magnesium-Ionen-freier Hank's ausgewogener Salzlösung und 0,1% Glukose. Dissoziieren Sie das Gewebe 10 Mal mechanisch, indem Sie mit einer 1.000-Mikroliter-Spitze in DMEM plus 10% FCS auf und ab pipettieren.
Zentrifugieren Sie das Homogenat eine Minute lang bei 100 g, sammeln Sie den Überstand und vervollständigen Sie das verbleibende Volumen in 1.000 Mikrolitern. Die Zellsuspension wird mit einer Dichte von 520 Zellen pro Quadratmillimeter auf Zellkulturschalen mit zwei Millilitern DMEM aufgetragen, die 10 % FCS, 1 % Penicillin-Streptomycin und 1 % eines essentiellen Aminosäurezusatzes enthalten. Bei 37 Grad Celsius in einer befeuchteten Umgebung mit 5% Kohlendioxid zwei Stunden lang inkubieren.
Um die Differenzierung der Nervenzellen zu ermöglichen, wechseln Sie das Medium mit dem serumfreien Nahrungsergänzungsmittel gegen ein serumfreies neurobasales Medium. Halten Sie die Kulturen bis zur Behandlung bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid. Mischen Sie zum Glühen zwei einzelsträngige Oligonukleotide mit komplementären Sequenzen in gleichen molaren Mengen.
Zwei Minuten bei 95 Grad Celsius erhitzen. Übertragen Sie die Proben aus dem Heizblock und verdünnen Sie das resultierende Produkt auf eine Endkonzentration von 0,5 Mikromolaren. Um das shRNA-Insert in den lentiviralen Vektor pLKO zu klonen.
3G, verdauen Sie ein Mikrogramm des Vektors mit EcoR1- und PAC1-Restriktionsenzymen. Durch Pipettieren vorsichtig mischen und die Reaktion drei bis vier Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren. Mischen Sie zur Ligatur den verdauten Vektor und fügen Sie ihn in einem molaren Verhältnis von 3:1 ein.
Inkubieren Sie es mit der T4-Ligase und dem Ligasepuffer über Nacht bei 16 Grad Celsius. Als nächstes mischen Sie die Komponente E.coli mit dem Gesamtvolumen der Ligationsreaktion und kühlen Sie sie 15 Minuten lang auf Eis. Legen Sie es für zwei Minuten in ein 42-Grad-Celsius-Bad und kühlen Sie es dann erneut 15 Minuten lang auf Eis.
Übertragen Sie das Gesamtvolumen, das einem Hitzeschock ausgesetzt ist, in ein 15-Milliliter-Röhrchen und vervollständigen Sie das Volumen auf 1.000 Mikroliter mit Luria-Bertani oder L-B flüssigem Medium. Schütteln Sie die Bakterien 90 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einem Orbitalschüttler bei ca. 330 U / min. Zentrifuge, die 5.000 G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius erfüllte.
Entsorgen Sie 900 Mikroliter des Überstands und verwenden Sie den verbleibenden Überstand, um das Pellet wieder zu suspendieren. Verteilen Sie die Bakteriensuspension gleichmäßig auf einer festen Ampicillin-LB-Platte und inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 Grad Celsius. Wählen Sie eine einzelne Kolonie aus, um sie in ein 15-Milliliter-Röhrchen mit 10 Millilitern L-B-flüssigem Medium und Ampicillin zu überführen.
Schütteln Sie die Bakterien bei 37 Grad Celsius bei etwa 330 U/min und zentrifugieren Sie die Kultur, um die Bakterien bei 5.000 G fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius zu pelletieren. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, konservieren Sie das Bakterienpellet bei minus 20 Grad Celsius. 24 Stunden vor der Transfektion 1 bis 5 Millionen HEK-293-Zellen in 100-Millimeter-Kulturschalen aussäen.
Mischen Sie 14 Mikrogramm pKLO. 3G-Vektor mit einem spezifischen Einsatz, 10,5 Mikrogramm Packplasmid psPAX und 3,5 Mikrogramm Hüllplasmid pMD2. G.Verdünnen Sie 45 Mikroliter Plasmid-Transfektionsreagenz in 700 Mikroliter reduziertem Serummedium und inkubieren Sie es fünf Minuten lang bei Raumtemperatur.
Kombinieren Sie dann die DNA-Mischung mit dem verdünnten Plasmid-Transfektionsreagenz, mischen Sie vorsichtig und inkubieren Sie sie 20 Minuten lang bei Raumtemperatur. Wechseln Sie nach der Transfektion das Medium der Kulturschale der HEK-293-Zellen durch ein frisches Medium und fügen Sie tropfenweise das gesamte Volumen der DNA-Lösung hinzu. Schaukeln Sie die Schale vorsichtig und inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid für 48 bis 72 Stunden, damit shRNAs ihre optimale Transduktion erreichen können.
Sammeln Sie das Medium mit Lentivirus und lagern Sie es bei vier Grad Celsius. Filtrieren Sie den Virusüberstand mit einer 0,45-Mikrometer-Nylonmembran und aliquotieren Sie einen Millimeter des Durchflusses. Vier Stunden lang bei 17.000 G zentrifugieren.
Entsorgen Sie den Überstand und bewahren Sie das Pellet auf. Lassen Sie das unsichtbare Pellet trocknen und lagern Sie es nach dem Trocknen bei minus 80 Grad Celsius. Infizieren Sie die primären kortikalen Neuronenkulturen mit spezifischen shRNA-Oligonukleotiden, die auf die drei Haupt-UTRs von Calcineurin A-alpha oder CHOP abzielen, und inkubieren Sie sie einen Tag lang bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid.
Danach GM2-Stammlösung in einer Endkonzentration von zwei Mikromolaren in das Medium der Kulturschale geben und bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für 16, 24 und 48 Stunden inkubieren. Fixieren Sie die Zellen mit 4% Paraformaldehyd und 120 Millimol Saccharose in PBS für 20 Minuten bei 37 Grad Celsius und waschen Sie sie dann mit PBS. Fügen Sie die Permeabilisierungslösung fünf Minuten lang hinzu und waschen Sie sie mit PBS.
Verwenden Sie 5% BSA, verdünnt in PBS für 45 Minuten, um eine Blockierung zu ermöglichen. Dann mit dem Anti-MAP2-Antikörper bei vier Grad Celsius über Nacht inkubieren. Nachdem Sie die Zellen am Ende der Inkubationszeit zweimal mit PBS gewaschen haben, inkubieren Sie eine Stunde lang mit einem sekundären Antikörper.
Montieren Sie die Gläser nach dem Waschen der Zellen mit PBS. Nachdem Sie die Bilder mit einem inversen Epifluoreszenzmikroskop erhalten haben, laden Sie das Bild, um ImageJ zu erhalten, und subtrahieren Sie den Hintergrund, indem Sie auf Prozess und dann auf Hintergrund subtrahieren klicken. Klicken Sie auf Bild, Anpassen, Schwellenwert, um die Mindestwerte anzupassen, sodass der Pfad und einige Nachzeichnungen unterschieden werden können.
Löschen Sie Somas mit der Freihandauswahl. Wählen Sie Traces und klicken Sie auf Bearbeiten, Auswahl, Auswahl erstellen. Holen Sie sich den ROI, indem Sie auf die Steuerungs- und T-Tasten der Auswahl klicken und ihn speichern.
Öffnen Sie das Originalbild. Klicken Sie auf das ROI-Manager-Panel und wählen Sie den Anfangs-ROI aus. Klicken Sie dann auf das Originalbild.
Sobald der ROI auf dem Bild verfolgt wird, drücken Sie die Strg- und M-Tasten, um die statistische Analyse zu verarbeiten. Hier wurde versucht zu überprüfen, ob das Silencing von 2pERK-Downstream-Komponenten die Übergangsphase der entfalteten Proteinantwort im ER-Stresszellmodell beeinflusst. Das Calcineurin-A-alpha-Gen und das CHOP-Gen wurden durch zwei spezifische shRNA-Sequenzen in einer primären Neuronenzellkultur für einen Tag zum Schweigen gebracht.
Der Ausdruck wird durch Western Blot analysiert. Es wird eine deutliche Hemmung des ER-Stress-vermittelten Calcineurin-A-alpha- und CHOP-Spiegelanstiegs in Knockdown-Zellen beobachtet. Der mögliche Zusammenhang zwischen GM2-Akkumulations-induziertem ER-Stress und neuronaler Degeneration wurde durch MAP2-Immunfärbung von primären neuronalen Kulturen untersucht.
Die Neuritenatrophie nimmt nach Induktion von ER-Stress durch Inkubation von GM2 nach 16 bis 48 Stunden signifikant zu. Die Stummschaltung der Calcineurin-A-alpha-Expression verstärkt signifikant die Neuritenatrophie, insbesondere nach 16 Stunden GM2-Akkumulation im Vergleich zu den unbehandelten GM2-Gruppen. Somit beschleunigte der Calcineurin-A-alpha-Knockdown den Degenerationsprozess in Neuronen und bestätigte den überlebensfördernden Effekt von Calcineurin während der frühen Phase der entfalteten Proteinantwort.
Umgekehrt führte der CHOP-Knockdown zu einer signifikant verringerten Neuritenatrophie im Vergleich zu den Kontrollen genau nach 16 bis 24 Stunden. das Zellprotokoll mit der richtigen primären Zellkultur und der Gewinnung von 90 oder mehr Prozent infizierter Zellen mit dem jeweiligen Lentivirus. Da der Verlust des Axons des neuronalen Terminals der erste Schritt ist, den wir in unserem Prozess festlegen, ist es auch möglich, dies durch die Durchführung eines Assays zu beurteilen.
Diese Technik ermöglicht es unserer Gruppe und anderen, einige Moleküle als potenzielle therapeutische Werkzeuge zu bewerten.
