اللجنين هو heteropolymer معقدة تتكون من ثلاثة monolignols. وهو ثاني أكثر البوليمرات وفرة على وجه الأرض بجوار السليلوز. هنا، ونحن نثبت طريقة حمض ثيوغليكوليك، وهو الأسلوب الأكثر موثوقية لتقدير محتوى اللجنين.
ويستند هذا الأسلوب على مبدأ أن اللجنين يربط حمض ثيوغليكوليك من خلال السندات ثيوثير. علاوة على ذلك، قسمنا هذا البروتوكول إلى خمس مراحل. في المرحلة الأولى، ونحن إعداد المواد النباتية.
في المرحلة الثانية، ونحن عزل استخراج الكحول غير قابل للذوبان. في المرحلة الثالثة، ونحن يعجل اللجنين باستخدام حمض ثيوغليكوليك والظروف الحمضية. في المرحلة الرابعة، ونحن نعد منحنى مستوى اللجنين باستخدام اللجنين الخيزران الصناعية.
وأخيرا، في المرحلة الخامسة، نقدر محتوى اللجنين باستخدام المنحنى القياسي الذي تم إعداده في المرحلة الرابعة. يتم جمع المواد النباتية، وقلب الأواني لفصل الجذور، وغسلها جيدا في الماء، والهواء المجفف لمدة يومين، ونقلها إلى حاويات تحمل علامات واحتضانها في الحاضنة في درجة مئوية 49 لمدة أسبوع إلى 10 أيام. باستخدام مقص، يتم قطع الأنسجة إلى قطع حجم 1 ملم إلى 3 ملم.
بدلا من ذلك يتم استخدام طاحونة الكتلة الحيوية لسحق الأنسجة النباتية. استخدام الأنسجة الجذرية بدوره على طاحونة الكتلة الحيوية جمع مسحوق سحقت في حاويات قبل المسمى. وبالمثل، كرر للأنسجة الجذعية والأنسجة ورقة.
يتم تحميل مسحوق سحقت في مزهرية طحن التي يتم وضعها بعد ذلك في طاحونة التجميد وتشغيل طاحونة التجميد بمعدل 10 CP سرعة لمدة ثلاث دورات. تزن 20 ملغ من مسحوق الأنسجة الأرضية ونقلها إلى أنبوب 2ml مسبقة الصنع. دون ملاحظة للأنبوب الفارغ وأنبوب مسحوق الأنسجة ومسحوق الأنسجة في دفتر ملاحظات المختبر.
احتضان الأنابيب مع غطاء مفتوح في 60 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. بعد الحضانة، أضف 1.8 مل من الماء إلى كل جهاز طرد مركزي دوامة عينة في 15،000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق. تجاهل supernatant إضافة 1.8 مل من الميثانول.
دوامة واحتضان في كتلة درجة مئوية مسخن 60 درجة لمدة 20 دقيقة بعد حضانة الطرد المركزي في 15،000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق. كرر هذه الخطوة مرة أخرى. بعد الطرد المركزي تجاهل supernatant وتجفيف الكريات في مجفف فراغ لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات أو حتى البليت جافة تماما.
قياس وتسجيل وزن كل أنبوب في دفتر الملاحظات المختبر لتقدير محتوى اللجنين في نهاية المطاف. وتشمل أيضا السيطرة الإيجابية الصناعية الخيزران اللجنين في هذه المرحلة بدءا من 0.5 ملغ إلى 4 ملغ في ثلاثية. إضافة 1 مل من 3 حمض الهيدروكلوريك العادي، جنبا إلى جنب مع مائة ميكرولتر من حمض الجليكوليك إلى كل دوامة عينة واحتضان في 80 درجة مئوية لمدة 3 ساعات.
بعد 3 ساعات حضانة نقلها إلى رف والسماح لها لتبرد لمدة 10 دقائق. ثم الطرد المركزي في 15، 000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق. بعد الطرد المركزي ، يبدو لون الحل هكذا.
تجاهل الناتنات الفائق. أضف 1 مل من الماء. دوامة الطرد المركزي في 15، 000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق.
تجاهل الناتنات الفائق. أضف 1 مل من هيدروكسيد الصوديوم العادي. دوامة واحتضان في 37 درجة مئوية شاكر بين عشية وضحاها.
بعد حضانة أجهزة الطرد المركزي بين عشية وضحاها الأنابيب في 15، 000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق. نقل الأنابيب الطازجة فائقة التسمية مسبقا 2 مل إضافة 200 ميكرولتر من حمض الهيدروكلوريك المركزة إلى supernatant. مزجها عن طريق عكس لطيف كما هو مبين هنا.
احتضانهم في الثلاجة في درجة مئوية 4 بين عشية وضحاها. بعد حضانة الطرد المركزي في 15، 000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق. تجاهل الناتنات الفائق.
أضف 1 مل من هيدروكسيد الصوديوم. دوامة واحتضان في شاكر في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 إلى 15 دقيقة. استخدام مطياف لجمع قراءات امتصاص 280 نانومتر، واتخاذ 2 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم كما فارغة منذ اللجنين عجلت يذوب في هيدروكسيد الصوديوم.
جعل فارغة إلى الصفر. وبالمثل، كرر للعينات. استخدم اثنين من الميكرويترات لكل عينة لجمع قراءات الامتصاص في دفتر ملاحظات المختبر الخاص بك.
خذ ثلاث قراءات لكل عينة لثلاث نسخ متماثلة تقنية. في العمود الأول، لدينا رقم العينة. في العمود الثاني، لدينا تكرارات بيولوجية حيث R1، R2، R3 تمثل ثلاثة تكرارات بيولوجية لخط تجريبي واحد.
في العمود الثالث، قمنا بمتوسط قراءات الامتصاص التي تم الحصول عليها عند 280 نانومتر. قمنا بحساب محتوى اللجنين في العمود الرابع باستخدام الصيغة y = mx-c حيث x هو متوسط قيم OD.m ويتم رسم قيم c من خط الانحدار للمنحنى القياسي المعد. العمود الخامس هو الوزن بعد غسل الميثانول والماء.
لذلك هذه هي الطريقة التي يتم استخدامها لتقدير محتوى اللجنين في ملغ. لذلك نقسم القيمة التي تم الحصول عليها في العمود الرابع على العمود الخامس للحصول على القيمة لكل ملغ من محتوى اللجنين في العمود السادس. وهذه القيمة مضروبة في 1000 من أجل الحصول على وزن جدار الخلية لكل غرام.
ويتم حساب النسبة المئوية لمحتوى اللجنين بقسمة هذه القيمة على 1000 والضرب ب 100. وأخيرا، نحصل على متوسط اللجنين عن طريق متوسط اللجنين من ثلاث نسخ بيولوجية لكل خط تجريبي والتي سيتم مقارنتها بمتوسط خط تجريبي آخر في شكل رسم بياني شريطي لفهم الاختلافات في محتوى اللجنين. يمكننا أيضا تطبيق الطالب تي اختبار لاختبار مستوى أهميتها.
في العمود A، لدينا اللجنين الخيزران التجارية، ومن ثم وزن اللجنين الخيزران التي اتخذت قبل TGA وقراءات امتصاص كل منهما في 280 نانومتر. استخدمت هذه القيم في الجدول أ لرسم رسم بياني مبعثر في العمود B، والذي يعطينا خط الانحدار مع قيم m و c. في C، قارنا القيم التي تم الحصول عليها باستخدام منحنى القياسية والخيزران الصناعي اللجنين الخط التجريبي واحد واثنين تمت مقارنتها في شكل رسم بياني شريط والنتيجة هي أنها تظهر الفرق بين بعضها البعض.
