هذا العملية يمكن أن تساعدنا على دراسة التغيرات الديناميكية للمكونات الهيكلية نانو من آلات النقل الكهربائية الميكانيكية على سطح حزم ستيريوسيليا خلية الشعر. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي التصوير الفاصل الزمني لسطح الخلايا الحية ذات التضاريس المعقدة بدقة نانومتر واحدة ، ودون إجراء اتصال مادي مع العينة. يمكن تطبيق هذه التقنية على أي خلية حية تقريبا.
كنا في السابق مطابقة سطح خطوط الخلايا الظهارية الرئة المصابة بالفيروسات، والخلايا العضلية، في بلدي صورة البكتيريا قريبا. اختبار nanopipettes في بداية كل جلسة التصوير. بعد تصنيع nanopipette، تحقق من وجود فقاعات، وإزالة أي فقاعات إذا كان موجودا، وجبل nanopipette على القفز التحقيق أيون موصل حامل مجهر ماصة.
في أربعة ملليلتر من حل الحمام للغرفة ووضع الغرفة على خشبة المسرح HPICM. أدخل القطب الأرضي إلى محلول الحمام وتأكد من أن الجهد الذي يتم تطبيقه على المصصة من خلال مكبر الصوت المشبك التصحيح هو صفر. بعد وضع المتلاعب الصغير في الوضع الرأسي، حرك المصصة في Z حتى تلمس السائل وتعيين إزاحة مكبر الصوت إلى الصفر، قبل إضافة زائد 100 ملليفولت للتحقق من تيار ماصة.
استخدم غراء السيليكون لإرفاق معيار معايرة AFM للغرفة وتغطية العينة بأربعة ملليلترات من HBSS. استخدم الشريط على الوجهين لتأمين الغرفة إلى المرحلة X Y من إعداد HPICM، وتحميل nanopipette جديدة على حامل كما هو موضح. بعد اختبار المقاومة nanopipette وقطرها، تعيين التيار إلى واحد نانو أمبير.
استخدام المتلاعب المشبك التصحيح الخشنة لوضع nanopipette تقريبا فوق مركز معيار المعايرة وزيادة نقطة مجموعة أثناء رصد إشارة من جهاز استشعار المحرك بيزو Z على الذبذبة في الوقت الحقيقي. بعد إنشاء مستقرة قابلة للتكرار Z نهج دورة، تقليل نقطة مجموعة إلى قيمة فقط فوق نقطة عدم الاستقرار وتحريك ماصة أسفل بسرعة حوالي خمسة ميكرون في الثانية الواحدة، حتى تصل إلى العينة. سوف يزيد المستوى السفلي من إشارة تحديد المواقع Z في الوقت الحقيقي ، مما يشير إلى أن يتم سحب nanopipette بسبب استشعار سطح العينة.
بسبب تصاعد متفاوتة على معيار AFM، قد تكون أعلى نقطة في مجال الاهتمام غير معروف. لذلك، تعيين سعة التراجع ماصة إلى ما لا يقل عن 200 إلى 500 نانومتر. مع الحرص على عدم تجاوز الحد الأعلى لحركة مشغل بيزو Z ، ابدأ التصوير بدقة منخفضة.
بمجرد تحديد أعلى نقطة للعينة في منطقة التصوير ، قم بتقليل سعة القفزة وسحب المصة حوالي 200 ميكرون على طول محور Z لمنع أي تصادم غير مرغوب فيه مع العينة قبل نقلها إلى موقع X Y جديد. عند تحديد موقع منطقة الاهتمام، ابدأ التصوير بدقة أعلى. لتصوير خلايا الشعر السمعية، تأمين بحزم جهاز معزول حديثا من كورتي إلى غرفة باستخدام إما خيط الأسنان، أو ماصة زجاجية مرنة.
استخدام الشريط على الوجهين لتأمين بحزم الغرفة إلى مرحلة بيزو س ص وتحميل nanopipette جديدة على حامل كما هو موضح. بعد التحقق من مقاومة nanopipette ، استخدم المتلاعب الدقيق المشبك التصحيح لوضع nanopipette على منطقة خلايا الشعر أثناء مراقبة الجهاز من نبات كورتي X في المجهر المقلوب. سجل، في الوقت الحقيقي الحالي و Z إشارة تحديد المواقع على الذبذبة للتحقق مما إذا كان النظام مستقر مع نقطة محددة من 0.5٪ 6or أقل، وتحديد نقطة مجموعة الأمثل والنهج العينة كما هو موضح.
إجراء تصوير منخفض الدقة للعينة كما هو موضح باستخدام سعة قفزة لا تقل عن ستة إلى ثمانية ميكرون. إذا كان nanopipette يحتاج إلى نقل إلى موقع جديد X Y، تراجع ماصة حوالي 500 نانومتر لتجنب الاصطدام مع أي ميزات طويل القامة داخل الأنسجة وتكرار التصوير HPICM منخفضة الدقة حتى المنطقة ذات الاهتمام حيث توجد خلايا الشعر. ثم قم بتصوير المنطقة ذات الاهتمام بدقة أعلى في 15 دقيقة أو أقل.
يمكن استخدام بروتوكول HPICM لتصور أي خلايا حية ذات تضاريس معقدة ، مثل حزم خلايا الشعر السمعية الحية للفئران. على الرغم من إظهار دقة X Y أقل مقارنة بمسح صور المجهر الإلكتروني ، يمكن لصور HPICM حل الصفوف المختلفة من المجسمة بنجاح. شكل نصائح ستيريوسيليا وحتى وصلات نانومتر الخمسة الصغيرة التي تربط بين ستيريوسيليا المجاورة.
نظرا لطبيعة التصوير غير المتصلة ب HPICM ، يمكن إجراء التصوير المستمر الفاصل الزمني لنفس حزمة خلايا الشعر لعدة ساعات دون الإضرار بتماسك الحزمة. لاحظ أنه مع نقطة تعيين منخفضة جدا، قد يفسر النظام التقلبات الصغيرة في التيار على أنها تواجه سطح الخلية، مما يؤدي إلى ضوضاء النقطة البيضاء في الصورة. وبالمثل، قد تزيد اتساعات القفز الكبيرة من الرنين الجانبي للمصصة، مما يؤدي أيضا إلى إنتاج وحدات بكسل صاخبة.
في المقابل، إذا كانت سعة الهوب صغيرة جدا، أو كانت نقطة الإعداد مرتفعة جدا، فقد تصطدم النانوبايت بالعينة مما يؤدي إلى تصوير القطع الأثرية أو تلف حزمة الشعر. أهم شيء يجب تذكره عند محاولة هذا الإجراء هو قضاء أقل من 15 دقيقة لكل حزمة خلايا شعر عند العمل مع الخلايا الحية. بعد الحصول على صورة لحزمة الشعر ، يمكن للمرء أن يحاول الحصول على تسجيلات قناة واحدة من مواقع محددة على سطح stereocilia للإجابة على الأسئلة حول خصائص قناة mechanotransduction.
