Bu pratik, saç hücresi stereosilia demetlerinin yüzeyindeki mekanik elektrik transdüksiyon makinelerinin nano yapısal bileşenlerinin dinamik değişikliklerini incelememize yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, tek nanometre çözünürlüğünde ve örneklem ile fiziksel temas kurmadan karmaşık topografya ile canlı hücrelerin yüzeyinin hızlandırılmış görüntülenmesidir. Bu teknik hemen hemen her canlı hücreye uygulanabilir.
Daha önce My Image Bacteria Soon'da virüslerle, kas hücreleriyle enfekte olmuş akciğer epitel hücre çizgilerinin yüzeyini eşleştirmiştik. Nanopipettes her görüntüleme seansının başında test edin. Bir nanopipette imal ettikten sonra kabarcıkları kontrol edin, varsa kabarcıkları çıkarın ve nanopipette'i atlamalı prob iyon iletkenliği mikroskop pipet tutucusuna monte edin.
Odaya dört mililitre banyo çözeltisinde ve odayı HPICM aşamasına yerleştirin. Zemin elektrodünü banyo çözeltisine tanıtın ve yama kelepçesi amplifikatöründen pipete uygulanan voltajın sıfır olduğundan emin olun. Mikro manipülatörü dikey konuma yerleştirdikten sonra, pipet akımını kontrol etmek için artı 100 milivolt eklemeden önce, pipeti sıvıya dokunana kadar Z'de hareket ettinin ve amplifikatör ofsetini sıfıra ayarlayın.
AFM kalibrasyon standardını odaya bağlamak ve numuneyi dört mililitre HBSS ile örtmek için silikon yapıştırıcı kullanın. Hazneyi HPICM kurulumunun X Y aşamasına sabitlemek için çift taraflı bant kullanın ve gösterildiği gibi tutucuya yeni bir nanopipette yükleyin. Nanopipette direncini ve çapını test ettikten sonra, akımı bir nano amplifikap olarak ayarlayın.
Nanopipette'i kalibrasyon standardının merkezinin yaklaşık üstüne konumlandırmak ve Z piezo aktüatörün sensöründen gelen sinyali gerçek zamanlı olarak bir osiloskop üzerinde izlerken ayarlanan noktayı artırmak için kaba bir yama kelepçe manipülatörü kullanın. Kararlı bir tekrarlanabilir Z yaklaşım döngüsü oluşturduktan sonra, ayarlanan noktayı kararsızlık noktasının hemen üzerindeki değere düşürin ve pipeti numuneye ulaşana kadar saniyede yaklaşık beş mikron hızında aşağı hareket ettirin. Gerçek zamanlı Z konumlandırma sinyalinin alt seviyesi artacak ve nanopipette'in numune yüzeyini algılaması nedeniyle geri çekildiğini gösterecektir.
AFM standardına düzensiz montaj nedeniyle, ilgi alanının en yüksek noktası bilinmemeyebilir. Bu nedenle, pipet geri çekilmesinin genliğini en az 200 ila 500 nanometreye ayarlayın. Z piezo aktüatör hareketinin üst sınırını aşmamaya dikkat ederek, düşük çözünürlükte görüntülemeye başlayın.
Görüntüleme alanındaki numunenin en yüksek noktası belirlendikten sonra, hop genliğini azaltın ve yeni bir X Y konumuna taşımadan önce numuneyle istenmeyen çarpışmayı önlemek için pipeti Z ekseni boyunca yaklaşık 200 mikron geri alın. İlgi alanı bulunduğunda, görüntülemeye daha yüksek çözünürlükte başlayın. İşitsel saç hücresi görüntüleme için, diş ipi veya esnek cam pipetler kullanarak corti'nin yeni izole edilmiş bir organını bir odaya sıkıca sabitleyin.
Odayı X Y piezo aşamasına sıkıca sabitlemek ve gösterildiği gibi tutucuya yeni bir nanopipette yüklemek için çift taraflı bant kullanın. Nanopipette direncini kontrol ettikten sonra, Corti X bitkisinin organını ters bir mikroskopta gözlemlerken nanopiptiyi saç hücresi bölgesinin üzerine konumlandırmak için yama kelepçesi mikro manipülatörunu kullanın. Kayıt, sistemin %0,5%6 veya daha düşük bir ayar noktasıyla sabit olup olmadığını kontrol etmek ve en uygun ayar noktasını belirlemek ve numuneye gösterildiği gibi yaklaşmak için osiloskop üzerindeki gerçek zamanlı akım ve Z konumlandırma sinyali.
En az altı ila sekiz mikronluk bir atlama genliği kullanarak gösterildiği gibi numunenin düşük çözünürlüklü görüntülemesini gerçekleştirin. Nanopipette'in yeni bir X Y konumuna taşınması gerekiyorsa, dokudaki herhangi bir uzun özellik ile çarpışmayı önlemek için pipeti yaklaşık 500 nanometre geri çekin ve saç hücrelerinin bulunduğu ilgi alanına kadar düşük çözünürlüklü HPICM görüntülemeyi tekrarlayın. Ardından, ilgi çekici bölgeyi 15 dakika veya daha kısa bir sürede daha yüksek bir çözünürlükte görüntüleyin.
HPICM protokolü, canlı fare işitsel saç hücresi demetleri gibi karmaşık bir topografya ile canlı hücreleri görselleştirmek için kullanılabilir. Taramalı elektron mikroskopi görüntülerine kıyasla daha düşük bir X Y çözünürlüğü göstermesine rağmen, HPICM görüntüleri farklı stereosiliyal sıralarını başarıyla çözebilir. Stereosilia uçlarının şekli ve hatta bitişik stereosiliayı birbirine bağlayan küçük beş nanometre bağlantısı.
HPICM görüntülemenin temassız doğası göz önüne alındığında, aynı saç hücresi demetinin sürekli zaman atlamalı görüntülemesi, demet uyumluluğuna zarar vermeden birkaç saat boyunca yapılabilir. Çok düşük bir ayar noktasıyla, sistemin akımdaki küçük dalgalanmaları hücre yüzeyiyle karşılaşmak olarak yorumlayabileceğine ve görüntüde beyaz nokta gürültüsüne yol açıp yol açıp, bu nedenle de bu dalgalanmalara yol açıp, bu dalgalanmaların hücre yüzeyinden kaynaklanabileceğini unutmayın. Benzer şekilde, büyük atlama genlikleri pipetin yanal rezonansını artırabilir ve gürültülü piksellerin üretilmesine neden olabilir.
Buna karşılık, atlama genliği çok küçükse veya setpoint çok yüksekse, nanopipette örnekle çarpışarak görüntüleme yapıtları veya saç demeti hasarına neden olabilir. Bu prosedürü denerken hatırlanması gereken en önemli şey, canlı hücrelerle çalışırken saç hücresi demeti başına 15 dakikadan az zaman harcamaktır. Saç demetinin bir görüntüsünü aldıktan sonra, mekanotransdüksiyon kanalı özellikleri hakkındaki soruları yanıtlamak için stereosilia yüzeyindeki belirli konumlardan tek kanallı kayıtlar elde etmeye çalışılabilir.
