Эта практика может помочь нам изучить динамические изменения наноструктурных компонентов механического механизма электрической трансдукции на поверхности пучков стереоцилий волосковых клеток. Основным преимуществом данной методики является покадровая визуализация поверхности живых клеток со сложной топографией в однонанометровом разрешении, и без физического контакта с образцом. Этот метод может быть применен практически к любой живой клетке.
Ранее мы сопоставили поверхность эпителиальных клеточных линий легких, инфицированных вирусами, мышечными клетками, в My Image Bacteria Soon. Тестируйте нанопипетки в начале каждого сеанса визуализации. После изготовления нанопипетки проверьте наличие пузырьков, удалите все пузырьки, если таковые имеются, и установите нанопипетку на держатель пипетки ионной проводимости.
На четыре миллилитра раствора ванны вводят в камеру и помещают камеру на ступень HPICM. Введите заземляющий электрод в раствор ванны и убедитесь, что напряжение, подаваемое на пипетку через усилитель зажимного зажима, равно нулю. После размещения микроманипулятора в вертикальном положении переместите пипетку в Z, пока она не коснется жидкости, и установите смещение усилителя на ноль, прежде чем добавить плюс 100 милливольт для проверки тока пипетки.
Используйте силиконовый клей, чтобы прикрепить калибровочный стандарт AFM к камере и покрыть образец четырьмя миллилитрами HBSS. Используйте двустороннюю ленту, чтобы закрепить камеру на стадии X Y установки HPICM, и загрузите новую нанопипетку на держатель, как показано на рисунке. После тестирования сопротивления и диаметра нанопипетки установите ток на один наноампер.
Используйте грубый манипулятор зажимного зажима, чтобы расположить нанопипетку примерно над центром калибровочного эталона и увеличить заданное значение при мониторинге сигнала от датчика Z-пьезопривода на осциллографе в режиме реального времени. После установления стабильного повторяемого цикла подхода Z уменьшите заданное значение до значения чуть выше точки нестабильности и переместите пипетку вниз со скоростью примерно пять микрон в секунду, пока она не достигнет образца. Нижний уровень сигнала позиционирования Z в реальном времени увеличится, что указывает на то, что нанопипетка изымается из-за зондирования поверхности образца.
Из-за неравномерного монтажа на стандарте AFM самая высокая точка интересующей области может быть неизвестна. Поэтому установите амплитуду втягивания пипетки не менее чем на 200-500 нанометров. Заботясь о том, чтобы не превысить верхний предел движения пьезопривода Z, начните съемку с низким разрешением.
После того, как самая высокая точка образца в области визуализации была идентифицирована, уменьшите амплитуду прыжка и втяните пипетку примерно на 200 микрон вдоль оси Z, чтобы предотвратить любое нежелательное столкновение с образцом, прежде чем перемещать его в новое место X Y. Когда интересующая область будет найдена, начните визуализацию с более высоким разрешением. Для визуализации слуховых волосковых клеток надежно закрепите свежеизолированный орган Корти в камере, используя зубную нить или гибкие стеклянные пипетки.
Используйте двустороннюю ленту, чтобы надежно закрепить камеру на пьезо-стадии X Y и загрузить новую нанопипетку на держатель, как показано на рисунке. После проверки сопротивления нанопипетки используйте микроманипулятор с зажимом пластыря, чтобы расположить нанопипетку над областью волосковых клеток, наблюдая за органом растения Corti X в перевернутом микроскопе. Запишите ток в реальном времени и сигнал позиционирования Z на осциллографе, чтобы проверить, стабильна ли система с заданным значением 0,5%6 или ниже, и определить оптимальное заданное значение и приблизиться к образцу, как показано.
Выполните визуализацию образца с низким разрешением, как показано с использованием амплитуды прыжка не менее шести-восьми микрон. Если нанопипетку необходимо переместить в новое место X Y, втяните пипетку примерно на 500 нанометров, чтобы избежать столкновения с любыми высокими особенностями в ткани, и повторяйте визуализацию HPICM с низким разрешением до интересующей области, где расположены волосковые клетки. Затем визуализируйте интересующую область с более высоким разрешением за 15 минут или меньше.
Протокол HPICM может быть использован для визуализации любых живых клеток со сложной топографией, таких как живые слуховые пучки волосковых клеток крыс. Несмотря на более низкое разрешение X Y по сравнению со сканирующими изображениями электронной микроскопии, изображения HPICM могут успешно разрешать различные ряды стереоцилий. Форма наконечников стереоцилий и даже небольшие пятинанометровые звенья соединяют соседние стереоцилии.
Учитывая бесконтактный характер визуализации HPICM, непрерывная покадровая визуализация одного и того же пучка волосковых клеток может выполняться в течение нескольких часов без повреждения связности пучка. Обратите внимание, что при очень низком заданном значении система может интерпретировать небольшие колебания тока как столкновение с поверхностью ячейки, что приводит к шуму белых точек на изображении. Аналогичным образом, большие амплитуды прыжка могут увеличить боковой резонанс пипетки, что также приводит к образованию шумных пикселей.
Напротив, если амплитуда прыжка слишком мала или заданное значение слишком велико, нанопипетка может столкнуться с образцом, что приведет к повреждению артефактов визуализации или пучка волос. Самое главное, что нужно помнить при попытке этой процедуры, это потратить менее 15 минут на пучок волосковых клеток при работе с живыми клетками. После получения изображения пучка волос можно попытаться получить одноканальные записи из определенных мест на поверхности стереоцилий, чтобы ответить на вопросы о свойствах канала механотрансдукции.
