מעשי זה יכול לעזור לנו ללמוד שינויים דינמיים של הרכיבים המבניים ננו של מכונות טרנסדוקציה חשמלית מכנית על פני השטח של חבילות סטריאציליה תא השיער. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא הדמיה לשגות זמן של פני השטח של תאים חיים עם טופוגרפיה מורכבת ברזולוציה ננומטר יחיד, ומבלי ליצור מגע פיזי עם המדגם. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת כמעט על כל תא חי.
בעבר התאמנו את פני השטח של קווי תאי אפיתל ריאות נגועים בווירוסים, תאי שריר, בחיידקי התמונה שלי בקרוב. בדוק את הננו-אפיפטים בתחילת כל מפגש הדמיה. לאחר ייצור ננו-צינור, בדוק אם קיימות בועות, והרכיב את הננופיט על מחזיק המיקרוסקופ של יון הגשושית.
בארבעה מיליליטר של פתרון אמבטיה לתא ולהניח את התא על בימת HPICM. הציגו את האלקטרודה הקרקעית לתמיסת האמבטיה וודאו שהמתח המופעל על הפיפטה דרך מגבר המהדק הוא אפס. לאחר הצבת המניפולטור המיקרו במיקום האנכי, הזז את הפיפטה ב- Z עד שהוא נוגע בנוזל והגדיר את מגבר היסט לאפס, לפני הוספת פלוס 100 מילבולט כדי לבדוק את זרם הפיפטה.
השתמש בדבק סיליקון כדי לחבר את תקן הכיול AFM לתא ולכסות את המדגם בארבעה מיליליטר של HBSS. השתמש בסרט דו-צדדי כדי לאבטח את התא לשלב X Y של הגדרת HPICM, וטען ננו-צינור חדש על המחזיק כפי שהודגם. לאחר בדיקת התנגדות nanopipette וקוטר, להגדיר את הזרם למגבר ננו אחד.
השתמש במניפולציה של מהדק תיקון גס כדי למקם את הננו-צינור בערך מעל מרכז תקן הכיול ולהגדיל את הנקודה שנקבעה תוך ניטור האות מהחיישן של מפעיל Z piezo על אוסצילוסקופ בזמן אמת. לאחר יצירת מחזור גישת Z יציבה שחוזרת על עצמה, להקטין את הנקודה להגדיר לערך רק מעל נקודת חוסר היציבות ולהזיז את pipette למטה במהירות של כחמישה מיקרון לשנייה, עד שהוא מגיע המדגם. הרמה התחתונה של אות מיקום Z בזמן אמת תגדל, מה שמצביע על כך שהננו-פיפט נסוג עקב חישת משטח המדגם.
בשל הרכבה לא אחידה על תקן AFM, הנקודה הגבוהה ביותר של תחום העניין עשויה להיות לא ידועה. לכן, להגדיר את המשרעת של נסיגה pipette לפחות 200 עד 500 ננומטר. דואג לא לחרוג מהגבול העליון של תנועת מפעיל Z piezo, להתחיל הדמיה ברזולוציה נמוכה.
לאחר שזוהתה הנקודה הגבוהה ביותר של המדגם באזור ההדמיה, הפחיתו את משרעת הדילוג וחזרו בה מהצינור כ-200 מיקרון לאורך ציר Z כדי למנוע התנגשות לא רצויה עם המדגם לפני העברתה למיקום X Y חדש. כאשר אזור העניין אותר, התחל הדמיה ברזולוציה גבוהה יותר. להדמיית תאי שיער שמיעתיים, אבטחו היטב איבר מבודד טרי של קורטי לתא באמצעות חוט דנטלי, או פיפטות זכוכית גמישות.
השתמש בסרט דו-צדדי כדי לאבטח את התא היטב לשלב הפיזו X Y ולהעמיס ננו-צינור חדש על המחזיק כפי שהודגם. לאחר בדיקת עמידות nanopipette, להשתמש תיקון מהדק מיקרו מניפולטור כדי למקם את nanopipette מעל אזור תא השיער תוך התבוננות האיבר של צמח Corti X במיקרוסקופ הפוך. הקלט, אות המיקום הנוכחי בזמן אמת ו- Z באוסקילוסקופ כדי לבדוק אם המערכת יציבה עם נקודה מוגדרת של 0.5%6 או נמוכה יותר, ולקבוע את נקודת הסט האופטימלית ולגשת למדגם כפי שהודגם.
בצע הדמיה ברזולוציה נמוכה של המדגם כפי שהודגם באמצעות משרעת הופ של לפחות שישה עד שמונה מיקרון. אם הננו-צינור צריך לעבור למיקום X Y חדש, בטל את הפיפטה כ-500 ננומטרים כדי למנוע התנגשות עם תכונות גבוהות בתוך הרקמה וחזור על הדמיית HPICM ברזולוציה נמוכה עד לאזור העניין שבו ממוקמים תאי השיער. לאחר מכן צלם את אזור העניין ברזולוציה גבוהה יותר ב- 15 דקות או פחות.
ניתן להשתמש בפרוטוקול HPICM כדי לדמיין כל תא חי עם טופוגרפיה מורכבת, כגון חבילות תאי שיער שמיעתיים של חולדות חיות. למרות הדגמת רזולוציית X Y נמוכה יותר בהשוואה לסריקת תמונות מיקרוסקופיות אלקטרונים, תמונות HPICM יכולות לפתור בהצלחה את השורות השונות של סטריאוטיפיליה. הצורה של קצות סטריאוטיליה ואפילו חמשת ננומטר קטן קישורים המחברים את סטריאוטיפיליה הסמוכה.
בהתחשב באופי ללא מגע של הדמיית HPICM, הדמיה רציפה של אותה חבילת תאי שיער יכולה להתבצע במשך מספר שעות מבלי לפגוע בלכידות החבילה. שים לב כי עם נקודת קבוצה נמוכה מאוד, המערכת עשויה לפרש תנודות קטנות בזרם כמפגש עם משטח התא, מה שמוביל לרעש נקודה לבנה בתמונה. באופן דומה, משרעת הופ גדולה עשויה להגביר את התהודה לרוחב של הפיפטה, וכתוצאה מכך גם ייצור של פיקסלים רועשים.
לעומת זאת, אם משרעת הופ היא קטנה מדי, או נקודת הקבע גבוהה מדי, nanopipette עלול להתנגש עם המדגם וכתוצאה מכך חפצים הדמיה או נזק צרור שיער. הדבר החשוב ביותר לזכור בעת ניסיון הליך זה הוא לבלות פחות מ 15 דקות לכל חבילת תא שיער בעת עבודה עם תאים חיים. לאחר קבלת תמונה של חבילת השיער, ניתן לנסות להשיג הקלטות ערוץ יחיד ממיקומים ספציפיים על פני השטח של סטריאוטיפיליה כדי לענות על שאלות על תכונות ערוץ mechanotransduction.
