لدينا التحقيق FRET والبروتوكولات تمكين القياس الكمي السريع والحساس من elastase الحرة والسطح ملزمة والنشاط cathespin G في البلغم من المرضى الذين يعانون من أمراض مجرى الهواء العدلات. هذه الأساليب، تجعل من الممكن لاستكشاف جوانب مختلفة من الفيزيولوجيا المرضية proteases. تسمح قياسات قارئ اللوحات بإجراء فحوصات كبيرة.
تصور المجهر البؤري نشاط الإنزيم بمحلول دون خلايا. في حين تدفق قياس الخلايا، وتمكن فينومتيبينج خلية واحدة وكمية النشاط بروتياز بطريقة شخصية. يمكن توسيع نطاق هذه التقنية لتشمل أمراض مجرى الهواء المختلفة مثل التليف الكيسي أو التهاب القصبات الهوائية أو مرض الانسداد الرئوي المزمن.
ويمكن تكييفها مع BioSamples مختلفة مثل الدم أو الهوائيات الحويصلات أو عينات الفئران. قبل البدء في إجراء تحريض البلغم، يستنشق 200 ميكروغرام من مستقبلات بيتا 2 الخصوم سالبوتامول. بعد ذلك ، يستنشق محلول ملحي مفرط 6٪ لمدة 15 دقيقة باستخدام البخاخات.
جمع البلغم المتوقع في طبق بيتري. كتل مخاط منفصلة من اللعاب إلى طبق بيتري بمساعدة طرف ماصة. وزن المخاط، ثم إضافة أربعة أجزاء حجم لكل وزن من 10٪ Sputolysin وبرنامج تلفزيوني إلى البلغم.
احتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة على شاكر هزاز لمدة 15 دقيقة لإذابة المخاط. إخماد رد الفعل عن طريق إضافة ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني الباردة لكل ملليلتر من 10٪ Sputolysin. ماصة الخليط للحصول على حل متجانس.
تصفية الخليط من خلال مصفاة خلية النايلون 100 ميكرون في أنبوب 50 ملليلتر. كرر خطوة الترشيح من خلال مصفاة 40 ميكرون ، ثم الطرد المركزي لمدة 10 دقائق في 300 مرة G في أربع درجات مئوية. نقل supernatant في أنبوب جديد وتخزينها على الجليد.
إعادة إنفاق بلطف بيليه الخلية في 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني الباردة ووضعها على الجليد. تذوب الانزيمات على الجليد واقامة منحنى معيار الانزيم كما هو موضح في المخطوطة النصية. بالتوازي مع إعداد القياسية، تمييع عينات البلغم في المخزن المؤقت التنشيط.
على قارئ لوحة، تعيين الطول الموجي الإثارة للمسبار NE FRET NEmo-1 إلى 354 نانومتر والطول الموجي للانبعاثات إلى 400 نانومتر للمتبرع و 490 نانومتر للقبول. بالنسبة للمسبار CG FRET sSam ، حدد الطول الموجي للإثارة إلى 405 نانومتر والانبعاثات إلى 485 نانومتر للمتبرع ، و 580 نانومتر للمقبول. إضافة 40 ميكرولتر من العينات والمعايير، أو الفراغات في آبار سوداء 96 جيدا نصف لوحة المنطقة وإضافة المزيج الرئيسي.
بدء قارئ لوحة وتسجيل المانح لزيادة نسبة القبول بعد كل 60 إلى 90 ثانية لمدة 20 دقيقة على الأقل، أو حتى الزيادة في إشارة تصل إلى هضبة. تصدير البيانات وحساب نسبة المانح إلى المقبول عن طريق قسمة RFU المانحة على RFU القبول لكل نقطة زمنية وعينة. ثم حساب المانحة إلى نسبة القبول متوسط الانحراف المعياري.
تحديد الميل ضمن النمو الخطي للمانح لتغيير نسبة القبول. لكل قياس، resuspend 30،000 خلايا البلغم في حجم 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في أنبوب 1.5 ملليلتر. احتضان خلايا البلغم مع مثبط محدد كتحكم سلبي وانزيم مناسب كتحكم إيجابي لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
إضافة 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني يحتوي على مراسل FRET ووصمة عار نووية إلى كل أنبوب للحصول على تركيز نهائي من 2 ميكرومولار. احتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 إلى 20 دقيقة. إخماد رد الفعل عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من الجليد البارد PBS ووضع العينات على الجليد.
Cytospin الخليط على الشرائح المجهرية. ثم يجف الهواء وإصلاح الخلايا مع الجليد الباردة 10٪ الميثانول لمدة 10 دقائق. بعد التثبيت، والهواء الجاف وجبل العينة مع وسيطة تركيب المناسبة.
التقط الصور باستخدام مجهر كونفوجكال. صورة ما لا يقل عن 100 خلية لكل شرط للحصول على إحصاءات قاطعة. Resuspend 1 مليون خلية في 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في خمسة ملليلتر FACS البوليسترين جولة أنبوب القاع، ووضع الأنبوب على الجليد.
إضافة اثنين ميكرولتر من كتلة FC إلى كل عينة. ثم احتضان العينات لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. إضافة الأجسام المضادة كل أنبوب واحتضان على الجليد في الظلام لمدة 30 دقيقة.
غسل الخلايا مع اثنين من ملليلتر من برنامج تلفزيوني الباردة والطرد المركزي في 300 مرة G وأربع درجات مئوية. وأخيرا ، إعادة الإنفاق في 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. تقسيم التعليق إلى أنبوبين، 100 ميكرولتر لكل منهما وإضافة خمسة ميكرولترات من وصمة عار صلاحية الخلية.
إضافة مثبطات NSP محددة مناسبة إلى أنبوب التحكم السلبي واحتضان العينة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام. إضافة برنامج تلفزيوني إلى العينة وتصفية من خلال مرشح 40 ميكرون في أنبوب FACS نظيفة. إضافة المراسل إلى عينة التحكم السلبية ودوامة بلطف.
بدء الحصول على خلايا المحتضنة مع هذا المثبط محددة وإذا لزم الأمر، وضبط قليلا البوابات، فضلا عن الجهد PMTs مراسل. لتسجيل التغيرات في المتبرع لقبول نسبة بسبب نشاط البروتيز المرتبط بالغشاء ، سجل 1000 العدلات من كل أنبوب ، كل خمس إلى 10 دقائق. حساب نسبة FRET بقسمة المانح على قيم قناة المقبول للعينات التي تم قياسها على العدلات المفردة القابلة للتطبيق.
صور العدلات قبل احتضانها مع 100 ميكرومولار سيفيليستات أو تركت دون علاج قبل أن يتم عرض إضافة NEmo-2 المراسل هنا. واستخدمت الإشارة النووية لتحديد العدلات من خلال خصائصها النوى المجزأة، واختير عائد الاستثمار يدويا. المتبرع لقبول نسبة من العدلات البلغم تم رسمها.
تمثل كل نقطة متوسط عائد استثمار واحد. تدفق قياس الخلايا gating يجعل من الممكن التمييز ودراسة العدلات البلغم. ولوحظ توزيع ال MFI في صفر و 10 دقائق بعد إضافة المراسل.
تم حساب متوسط قيم MFI المانحة والمقبلة ل 1000 نيوتروفل البلغم. ووصلت نسبة D/A إلى مستوى مرتفع بعد زيادة أولية. المتبرعين الأصحاء البلغم التعريفي يأخذ بعض الممارسة قبل الكمال.
تذكر أن تسترخي وتتنفس الهباء الجوي لمدة 10 إلى 15 دقيقة قبل توقع. بالإضافة إلى ذلك، يحتفظ دائما خلايا البلغم على الجليد ومعالجتها في أقرب وقت ممكن بعد توقع. وجدنا أن نشاط البروتيز المرتبط بالسطح يرتبط بتلف الرئة المبكر لدى الأطفال وشدة أمراض الرئة لدى مرضى CF البالغين.
ولذلك معا، وهذه الأساليب تمكين استكشاف البروتياز والمؤشرات الحيوية التهاب في وقت مبكر في أمراض مجرى الهواء العدلات.
