Nossa sonda e protocolos FRET permitem a quantificação rápida e sensível da atividade de elastase e catesto g livre e superficial em escarro de pacientes com doenças das vias aéreas neutrófilas. Esses métodos possibilitam explorar diferentes aspectos da fisiopatologia proteases. As medidas do leitor de placas permitem grandes triagens.
A microscopia confocal visualiza a atividade enzimácica com solução subcelular. Enquanto a citometria de fluxo, permite a fenotipagem de células únicas e a quantificação da atividade protease de forma personalizada. Essa técnica pode ser expandida para diferentes doenças das vias aéreas, como fibrose cística, bronquiectásia ou DPOC.
E pode ser adaptado a diferentes biosamples, como sangue ou alveola lavash bronquial ou amostras de ratos. Antes de iniciar o procedimento de indução de escarro, inspire 200 microgramas dos antagonistas do receptor beta 2 salbutamol. Depois, inspire solução hipertônica 6% salina por 15 minutos usando um nebulizador.
Colete a escarro esperançosa em uma placa de Petri. Separe moitas de muco da saliva em uma placa de Petri com a ajuda de uma ponta de pipeta. Pese o muco, em seguida, adicione quatro partes de volume por peso de 10% Sputolysin e PBS à escarro.
Incubar a mistura à temperatura ambiente em um agitador de balanço por 15 minutos para dissolver o muco. Sacie a reação adicionando um mililitro de PBS frio para cada mililitro de 10% sputolysin. Pipeta a mistura para obter uma solução homogênea.
Filtre a mistura através de um coador de célula de nylon de 100 mícrons em um tubo de 50 mililitros. Repita a etapa de filtragem através de um coador de 40 mícrons, depois centrífuga por 10 minutos a 300 vezes G a quatro graus Celsius. Transfira o supernante para um tubo fresco e armazene-o no gelo.
Levemente resuspenque a pelota celular em 500 microliters de PBS frio e coloque-a no gelo. Descongelar enzimas no gelo e configurar uma curva padrão enzimária como descrito no manuscrito do texto. Paralelamente à preparação padrão, diluem amostras de escarro no buffer de ativação.
No leitor de placas, defina o comprimento de onda de excitação para a sonda NE FRET NEmo-1 a 354 nanômetros e o comprimento de onda de emissão para 400 nanômetros para doador e 490 nanômetros para acceptor. Para a sonda CG FRET, o sSam defina o comprimento de onda de excitação para 405 nanômetros e a emissão para 485 nanômetros para doador, e 580 nanômetros para acceptor. Adicione 40 microliters de amostras, padrões ou espaços em branco nos poços de uma placa preta de 96 bem meia área e adicione a mistura mestre.
Inicie o leitor de placas e regise o aumento da relação do doador após cada 60 a 90 segundos por pelo menos 20 minutos, ou até que o aumento do sinal atinja um patamar. Exporte os dados e calcule a razão doador para aceitador dividindo a RFU do doador pela RFU aceitadora para cada ponto de tempo e amostra. Em seguida, calcule a média de razão de aceitação do doador e o desvio padrão.
Determine a inclinação dentro do crescimento linear do doador para a mudança de proporção do aceitador. Para cada medição, resuspend 30.000 células de escarro em um volume de 50 microliters de PBS em um tubo de 1,5 mililitro. Incubar as células de escarro com um inibidor específico como controle negativo e uma enzima apropriada como controle positivo por 10 minutos à temperatura ambiente.
Adicione 50 microliters de PBS contendo repórter FRET e uma mancha nuclear em cada tubo para obter uma concentração final de 2 micromolar. Incubar a mistura em temperatura ambiente por 10 a 20 minutos. Sacia a reação adicionando 100 microliters de PBS gelado e coloca as amostras no gelo.
Citospine a mistura em lâminas de microscopia. Em seguida, o ar seque e fixe as células com gelo frio 10% de metanol por 10 minutos. Após a fixação, o ar seque e monte a amostra com um meio de montagem adequado.
Capture as imagens usando um microscópio confocal. Imagem de pelo menos 100 células por condição para estatísticas conclusivas. Resuspend 1 milhão de células em 100 microliters de PBS em um tubo de fundo de poliestireno facs de cinco mililitros, e coloque o tubo no gelo.
Adicione dois microliters de bloco FC a cada amostra. Em seguida, incubar as amostras por cinco minutos em temperatura ambiente. Adicione anticorpos cada tubo e incubar no gelo no escuro por 30 minutos.
Lave as células com dois mililitros de PBS frio e centrífuga a 300 vezes G e quatro graus Celsius. Finalmente, resuspend em 200 microliters de PBS. Divida a suspensão em dois tubos, 100 microliters cada e adicione cinco microliters de mancha de viabilidade celular.
Adicione o inibidor NSP específico apropriado ao tubo de controle negativo e incubar a amostra por 10 minutos à temperatura ambiente no escuro. Adicione PBS à amostra e filtre-a através de um filtro de 40 mícrons em um tubo FACS limpo. Adicione o repórter à amostra de controle negativo e suavemente vórtice.
Comece a adquirir células incubadas com este inibidor específico e, se necessário, ajuste ligeiramente os portões, bem como as tensões dos PMTs do repórter. Para registrar mudanças no doador para aceitar uma razão devido à atividade de protease ligada à membrana, regise 1000 neutrófilos de cada tubo, a cada cinco a 10 minutos. Calcule a razão FRET dividindo o doador pelos valores do canal aceitador para as amostras medidas nos neutrófilos únicos viáveis fechados.
Imagens de neutrófilos pré-incubados com 100 micromolar Sivilestat ou não tratados antes da adição do repórter NEmo-2 são mostradas aqui. O sinal nuclear foi utilizado para identificar neutrófilos por suas características segmentados núcleos e o ROI foi selecionado manualmente. O doador para aceitar uma proporção de neutrófilos de escarro foi plotado.
Cada ponto representa a média de um ROI. A citometria de fluxo permite discriminar e estudar neutrófilos de escarro. A distribuição do MFI em zero e 10 minutos foi observada após a adição de repórteres.
Foram calculados os valores médios de MFI para 1000 neutrófilos de escarro. A razão D/A atingiu um patamar após um aumento inicial. A indução de escarro de doadores saudáveis requer alguma prática antes da perfeição.
Lembre-se de relaxar e respirar o aerossol por 10 a 15 minutos antes da expectativa. Além disso, sempre mantém células de escarro no gelo e processá-las o mais rápido possível após a expectativa. Descobrimos que a atividade protease ligada à superfície se correlaciona com danos pulmonares precoces em crianças e com gravidade da doença pulmonar em pacientes adultos cf.
Portanto, juntos, esses métodos permitem a exploração de proteases como biomarcadores de inflamação precoce em doenças das vias aéreas neutrófilas.
