당사의 FRET 프로브 및 프로토콜은 호중구기도 질환을 가진 환자로부터 가래로 자유롭고 표면에 묶인 엘라스타제 및 카테스핀 G 활성의 신속하고 민감한 정량화를 가능하게 합니다. 이러한 방법은, 프로테아이즈 병리학의 다른 측면을 탐구할 수 있도록 합니다. 플레이트 판독기 측정은 대형 스크리닝을 허용합니다.
공초점 현미경 검사는 세포 외 용액으로 효소 활성을 시각화합니다. 유동 세포측정을 하면서 단일 세포 phenotyping및 프로테아제 활성 정량화를 개인화된 방식으로 가능하게 합니다. 이 기술은 낭포성 섬유증, 기관지혈증 또는 COPD와 같은 다른 기도 질병으로 확장될 수 있습니다.
그리고 혈액 이나 기관지 알베올라 용암 또는 마우스 샘플과 같은 다른 바이오 샘플에 적응 될 수있다. 가래 유도 절차를 시작하기 전에, 베타 2 수용체 길항제 살부타몰의 200 마이크로그램을 흡입한다. 그 후 분무기를 사용하여 15 분 동안 고독 6 % 식염수 용액을 흡입하십시오.
페트리 요리로 기대되는 가래를 모으세요. 타액에서 튀는 점액을 파이펫 팁의 도움으로 페트리 접시에 넣습니다. 점액의 무게를 측정한 다음 가래에 10%스푸토리신과 PBS의 중량당 4개의 부피 부품을 추가합니다.
점액을 용해하기 위해 흔들 셰이커에 실온에서 혼합물을 15 분 동안 배양합니다. 10%의 스푸토리신에 대해 차가운 PBS 1밀리리터를 첨가하여 반응을 담금질합니다. 균일한 용액을 얻기 위해 혼합물을 피펫한다.
100 미크론 나일론 세포 여과기를 통해 혼합물을 50 밀리리터 튜브로 필터링합니다. 40 미크로네 여과기를 통해 여과 단계를 반복한 다음 섭씨 4도에서 300 배 G에서 원심 분리기를 10 분 동안 반복하십시오. 상체를 신선한 튜브로 옮기고 얼음 위에 보관하십시오.
차가운 PBS의 500 마이크로 리터에 세포 펠릿을 부드럽게 다시 중단하고 얼음에 놓습니다. 얼음에 효소를 해동하고 텍스트 원고에 설명된 대로 효소 표준 곡선을 설정합니다. 표준 준비와 병행하여 가래 샘플을 활성화 버퍼에서 희석시.
플레이트 판독기에서, NE FRET 프로브 NEmo-1 내지 354 나노미터 및 방출 파장을 기증자를 위한 400 나노미터 및 수용자를 위한 490 나노미터에 대한 여기 파장을 설정한다. CG FRET 프로브 sSam의 경우 공여자용 485나노미터, 수용자용 580나노미터로 발산 파장을 405나노미터로 설정하고 방출을 설정했다. 40 마이크로리터의 샘플, 표준 또는 블랭크를 블랙 96 웰 하프 에어리어 플레이트의 우물에 넣고 마스터 믹스를 추가합니다.
플레이트 판독기를 시작하고 기증자에게 60~90초마다 20분 이상 또는 신호의 증가가 고원에 도달할 때까지 기록한다. 각 시간 지점 및 샘플에 대해 기부자 RFU를 수락자 RFU로 나누어 데이터를 내보내고 기부자RFU를 수락비율을 계산합니다. 그런 다음 기증자를 계산하여 수용자 비율 평균 및 표준 편차를 계산합니다.
기증자의 선형 성장 내의 경사를 받아수대 비율 변경으로 결정합니다. 각 측정에 대해, 1.5 밀리리터 튜브에서 PBS의 50 마이크로 리터의 부피에서 30, 000 가래 세포를 다시 중단합니다. 가래 세포를 특정 억제제로서, 실온에서 10분 동안 양성 조절으로 적절한 효소를 배양한다.
FRET 리포터와 핵 얼룩을 함유한 PBS 50마이크로리터를 각 튜브에 추가하여 최종 농도2마이크로몰러를 얻습니다. 10-20 분 동안 실온에서 혼합물을 배양합니다. 얼음 차가운 PBS의 100 마이크로 리터를 추가하여 반응을 담금질하고 얼음에 샘플을 배치합니다.
세포스핀은 현미경 슬라이드에 혼합물을 스핀. 그런 다음 공기 건조하고 10 분 동안 얼음 차가운 10 %의 메탄올로 세포를 고정합니다. 고정 후, 공기 건조및 적절한 장착 매체와 샘플을 장착.
공초점 현미경을 사용하여 이미지를 캡처합니다. 결정적인 통계를 위해 조건당 적어도 100개의 셀을 이미지. 5 밀리리터 FACS 폴리스티렌 라운드 하단 튜브에서 PBS의 100 마이크로 리터에서 1 백만 세포를 다시 중단하고, 얼음에 튜브를 배치합니다.
각 샘플에 FC 블록의 마이크로리터 2개를 추가합니다. 그런 다음 실온에서 5 분 동안 샘플을 배양합니다. 각 튜브를 넣고 어둠 속에서 얼음에 30분 동안 배양합니다.
감기 PBS와 원심분리기 의 2 밀리리터로 세포를 300 배 G와 섭씨 4도로 씻어 내보겠습니다. 마지막으로, PBS의 200 마이크로 리터에서 다시 중단. 서스펜션을 각각 100마이크로리터의 2개의 튜브로 나누고 5개의 마이크로리터의 세포 생존성 얼룩을 추가합니다.
부정적인 제어 관에 적절한 특정 NSP 억제제를 추가하고 어둠 속에서 실온에서 10 분 동안 샘플을 배양한다. 샘플에 PBS를 추가하고 깨끗한 FACS 튜브에 40 미크론 필터를 통해 필터링합니다. 기자를 음수 제어 샘플에 넣고 부드럽게 소용돌이를 넣습니다.
이 특정 억제제로 인큐베이팅된 세포를 획득하기 시작하고 필요한 경우 기자 PMTs 전압뿐만 아니라 게이트를 약간 조정합니다. 막 바운드 프로테아제 활성으로 인한 비율을 받아들이는 기증자의 변화를 기록하려면 각 튜브에서 1000마리의 호중구를 5~10분마다 기록합니다. 게이트된 실행 가능한 단일 호중구에서 측정된 샘플에 대한 수락자 채널 값으로 기증자를 분할하여 FRET 비율을 계산합니다.
100 마이크로몰러 시빌레스타(Sivilestat)로 미리 배양된 호중구의 이미지는 NEmo-2 추가 기자가 추가되기 전에 치료되지 않은 상태로 남겨진 것으로 나타났다. 핵 신호는 그들의 특성에 의해 호중구를 식별하는 데 사용되었고, ROI는 수동으로 선택되었다. 가래 호중구의 비율을 받아들이는 기증자는 플롯되었습니다.
각 점은 하나의 ROI의 평균을 나타냅니다. 유동 세포측정제 게이팅은 가래 호중구를 차별하고 연구할 수 있게 합니다. MFI 분포는 리포터 추가 후 0분 과 10분 후에 관찰되었다.
1000 개구체 호중구에 대한 평균 기증자 및 수용자 MFI 값을 계산했다. D/A 비율은 초기 증가 후 고원에 도달했습니다. 건강한 기증자 가래 유도는 완벽하기 전에 몇 가지 연습을합니다.
휴식과 예상 하기 전에 10~15 분 동안 에어로졸호흡 을 잊지 마십시오. 또한, 항상 가래 세포를 얼음에 보관하고 예상 후 가능한 한 빨리 처리합니다. 우리는 표면 결합 된 protease 활동이 아이들에 있는 초기 폐 손상 및 성인 CF 환자에 있는 폐 질병의 엄격과 상관관계가 있다는 것을 것을을 발견했습니다.
따라서 이러한 방법을 함께 사용하면 호중구기도 질환의 초기 염증 바이오마커로서 프로테아제의 탐사를 가능하게 한다.
