Nuestra sonda FRET y nuestros protocolos permiten la cuantificación rápida y sensible de la actividad libre y superficial de la elastasa y del cathespin G en esputo de pacientes con enfermedades neutrophilic de la vía aérea. Estos métodos, permiten explorar diferentes aspectos de la fisiopatología de las proteasas. Las mediciones del lector de placas permiten grandes cribados.
La microscopia confocal visualiza la actividad enzimática con la solución subcelular. Mientras que la citometría de flujo, permite el fenotipado unicelular y la cuantificación de la actividad proteasa de una manera personalizada. Esta técnica se puede ampliar a diferentes enfermedades de las vías respiratorias como la fibrosis quística, la bronquiectasia o la EPOC.
Y se puede adaptar a diferentes BioSamples como muestras de sangre o alveola lavash bronquial o ratones. Antes de comenzar el procedimiento de inducción del esputo, inhale 200 microgramos de los antagonistas del receptor beta 2 salbutamol. Después, inhale una solución salina hipertónica al 6% durante 15 minutos con un nebulizador.
Recoger el esputo expectorado en una placa de Petri. Separe los grupos de moco de la saliva en una placa de Petri con la ayuda de una punta de pipeta. Pesar el moco, luego agregue cuatro partes de volumen por peso de 10% Sputolysin y PBS al esputo.
Incubar la mezcla a temperatura ambiente en una coctelera oscilante durante 15 minutos para disolver el moco. Apasionar la reacción añadiendo un mililitro de PBS frío por cada mililitro de 10% Sputolysin. Pipetear la mezcla para obtener una solución homogénea.
Filtre la mezcla a través de un colador de células de nylon de 100 micras en un tubo de 50 mililitros. Repita el paso de filtración a través de un colador de 40 micras, luego centrífuga durante 10 minutos a 300 veces G a cuatro grados Celsius. Transfiera el sobrenadante a un tubo fresco y guárdelo en el hielo.
Resuspend suavemente el pellet celular en 500 microlitros de PBS frío y colóquelo sobre hielo. Descongelar las enzimas en el hielo y establecer una curva estándar de enzimas como se describe en el manuscrito del texto. En paralelo a la preparación estándar, diluya las muestras de esputo en el búfer de activación.
En el lector de placas, establezca la longitud de onda de excitación para la sonda NE FRET NEmo-1 en 354 nanómetros y la longitud de onda de emisión en 400 nanómetros para el donante y 490 nanómetros para el aceptor. Para la sonda CG FRET sSam estableció la longitud de onda de excitación en 405 nanómetros y la emisión en 485 nanómetros para el donante y 580 nanómetros para el aceptor. Agregue 40 microlitros de muestras, estándares o espacios en blanco en los pozos de una placa negra de media área de 96 pozos y agregue la mezcla maestra.
Encence el lector de placas y registre el aumento de la relación donante a aceptor después de cada 60 a 90 segundos durante al menos 20 minutos, o hasta que el aumento de la señal alcance una meseta. Exporte los datos y calcule la relación donante/aceptor dividiendo la RFU donante por la RFU aceptora para cada punto de tiempo y muestra. A continuación, calcule la media y la desviación estándar de la relación donante/aceptor.
Determinar la pendiente dentro del crecimiento lineal del cambio de la relación donante a aceptor. Para cada medición, resuspend 30,000 células de esputo en un volumen de 50 microlitros de PBS en un tubo de 1.5 mililitros. Incubar las células de esputo con un inhibidor específico como control negativo y una enzima apropiada como control positivo durante 10 minutos a temperatura ambiente.
Agregue 50 microlitros de PBS que contengan fret reporter y una mancha nuclear a cada tubo para obtener una concentración final de 2 micromolares. Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 10 a 20 minutos. Apaúde la reacción añadiendo 100 microlitros de PBS helado y coloque las muestras en hielo.
Cytospin la mezcla en portaobjetos de microscopía. Luego seque al aire y fije las células con helado al 10% de metanol durante 10 minutos. Después de la fijación, seque al aire y monte la muestra con un medio de montaje apropiado.
Capture las imágenes usando un microscopio confocal. Imagen de al menos 100 celdas por condición para obtener estadísticas concluyentes. Resuspend 1 millón de células en 100 microlitros de PBS en un tubo inferior redondo del poliestireno facs de cinco mililitros, y coloque el tubo en el hielo.
Agregue dos microlitros de bloque FC a cada muestra. A continuación, incubar las muestras durante cinco minutos a temperatura ambiente. Agregue anticuerpos a cada tubo e incube en hielo en la oscuridad durante 30 minutos.
Lave las células con dos mililitros de PBS frío y centrífuga a 300 veces G y cuatro grados Centígrados. Finalmente, resuspend en 200 microlitros de PBS. Divida la suspensión en dos tubos, 100 microlitros cada uno y agregue cinco microlitros de mancha de viabilidad celular.
Agregue el inhibidor específico apropiado de NSP al tubo de control negativo e incube la muestra durante 10 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Agregue PBS a la muestra y filtre a través de un filtro de 40 micras en un tubo FACS limpio. Agregue el reportero a la muestra de control negativo y suavemente vórtice.
Comience a adquirir células incubadas con este inhibidor específico y, si es necesario, ajuste ligeramente las puertas, así como los voltajes de los PMTs reporteros. Para registrar los cambios en el donante para aceptar una proporción debido a la actividad de la proteasa unida a la membrana, registre 1000 neutrófilos de cada tubo, cada cinco a 10 minutos. Calcule la relación FRET dividiendo al donante por los valores del canal aceptor para las muestras medidas en los neutrófilos individuales viables bloqueados.
Las imágenes de neutrófilos preincubados con 100 micromolares Sivilestat o dejados sin tratar antes de la adición de reportero NEmo-2 se muestran aquí. La señal nuclear se utilizó para identificar neutrófilos por sus características de núcleos segmentados y el ROI se seleccionó manualmente. Trazaron al donante para aceptar un ratio de neutrófilos del esputo.
Cada punto representa la media de un ROI. La citometría de flujo permite discriminar y estudiar neutrófilos de esputo. La distribución de la IMF a cero y 10 minutos se observó después de la adición del reportero.
Los valores malos del donante y del aceptor MFI para 1000 neutrófilos del esputo eran calculados. La relación D/A alcanzó una meseta después de un aumento inicial. La inducción de esputo de donantes sanos toma algo de práctica antes de la perfección.
Recuerde relajarse y respirar el aerosol durante 10 a 15 minutos antes de la expectoración. Además, siempre mantiene las células de esputo en el hielo y procesarlas tan pronto como sea posible después de la expectoración. Encontramos que la actividad de la proteasa ligada a la superficie correlaciona con daño pulmonar temprano en niños y con la severidad de la enfermedad pulmonar en pacientes adultos de los CF.
Por lo tanto juntos, estos métodos permiten la exploración de proteasas como biomarcadores tempranos de la inflamación en enfermedades neutrophilic de la vía aérea.
