FRET probumuz ve protokollerimiz, nötrofilik hava yolu hastalıkları olan hastalardan balgamda serbest ve yüzeye bağlı elastaz ve katespin G aktivitesinin hızlı ve hassas bir şekilde ölçülmesini sağlar. Bu yöntemler, proteaz patofizyolojisinin farklı yönlerini keşfetmeyi mümkün kınıyor. Plaka okuyucu ölçümleri büyük taramalar için izin alır.
Konfokal mikroskopi, hücre altı çözelti ile enzim aktivitesini görselleştirir. Akış sitometrisi iken, kişiselleştirilmiş bir şekilde tek hücreli fenotipleme ve proteaz aktivitesi nicelemesini sağlar. Bu teknik kistik fibrozis, bronşektazi veya KOAH gibi farklı hava yolu hastalıklarına genişletilebilir.
Ve kan veya bronş alveola lavaş veya fare örnekleri gibi farklı BioSamples uyarlanabilir. Balgam indüksiyon prosedürüne başlamadan önce, beta 2 reseptör antagonistlerinin 200 mikrogramını salbutamol içine alın. Daha sonra, bir nebülizör kullanarak 15 dakika boyunca hipertonik% 6 salin çözeltisini solu.
Balgam salımını petri kabında toplayın. Mukus kümelerini tükürüğe bir pipet ucu yardımıyla bir Petri kabına ayırın. Mukusu tartın, ardından balgama% 10 Sputolysin ve PBS ağırlığı başına dört hacimli parça ekleyin.
Mukusu çözmek için karışımı oda sıcaklığında sallanan bir çalkalayıcı üzerinde 15 dakika kuluçkaya bırakın. %10 Sputolysin'in her mililitresi için bir mililitre soğuk PBS ekleyerek reaksiyonun söndürünün. Homojen bir çözelti elde etmek için karışımı pipetleyin.
Karışımı 100 mikron naylon hücre süzgecinden 50 mililitrelik bir tüpe filtreleyin. Filtrasyon adımını 40 mikronluk bir süzgeçten tekrarlayın, ardından dört santigrat derecede 300 kez G'de 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatant'ı taze bir tüpe aktarın ve buzda saklayın.
Hücre peletini 500 mikrolitre soğuk PBS'de hafifçe yeniden depolayın ve buza yerleştirin. Buz üzerindeki enzimleri çözün ve metin el yazmasında açıklandığı gibi bir enzim standart eğrisi ayarlayın. Standart preparasyona paralel olarak, balgam örneklerini aktivasyon tamponunda seyreltin.
Plaka okuyucuda, NE FRET probu NEmo-1 için heyecan dalga boyunu 354 nanometreye ve emisyon dalga boyunu donör için 400 nanometreye ve kabul eden için 490 nanometreye ayarlayın. CG FRET probu için sSam, ekscitasyon dalga boyunu 405 nanometreye ve emisyonu donör için 485 nanometreye ve kabul eden için 580 nanometreye ayarlayın. Siyah 96 kuyu yarım alan plakasının kuyularına 40 mikrolitre numune, standart veya boşluk ekleyin ve ana karışımı ekleyin.
Plaka okuyucuyu başlatın ve en az 20 dakika boyunca her 60 ila 90 saniyede bir veya sinyaldeki artış bir platoya ulaşana kadar bağışçıyı kabul eden oran artışına kaydedin. Verileri dışa aktarın ve donör RFU'yu her zaman noktası ve örnek için alıcı RFU'ya bölerek bağışçıyı alıcı oranına hesaplayın. Daha sonra bağışçıyı alıcı oranı ortalamasına ve standart sapmaya hesaplayın.
Donörün doğrusal büyümesi içindeki eğimi alıcı oranı değişikliğine belirleyin. Her ölçüm için, 1,5 mililitrelik bir tüpte 50 mikrolitre PBS hacminde 30.000 balgam hücresi yeniden biriktirin. Balgam hücrelerini negatif kontrol olarak belirli bir inhibitör ve oda sıcaklığında 10 dakika pozitif kontrol olarak uygun bir enzim ile kuluçkaya yatırın.
2 mikromolar son konsantrasyon elde etmek için her tüpe FRET muhabiri ve bir nükleer leke içeren 50 mikrolitre PBS ekleyin. Karışımı oda sıcaklığında 10 ila 20 dakika kuluçkaya bırakın. 100 mikrolitre buz gibi PBS ekleyerek reaksiyonun söndür ve numuneleri buza yerleştirin.
Karışımı mikroskopi slaytlarında cytospin. Daha sonra hava kurutun ve hücreleri 10 dakika boyunca buz gibi% 10 metanol ile sabitleyin. Sabitlemeden sonra, numuneyi uygun bir montaj ortamı ile kurutun ve monte edin.
Konfokal mikroskop kullanarak görüntüleri yakalayın. Kesin istatistikler için durum başına en az 100 hücreyi görüntüleyin. Beş mililitrelik FACS polistiren yuvarlak alt tüpte 100 mikrolitre PBS'de 1 milyon hücreyi yeniden biriktirin ve tüpü buza yerleştirin.
Her örneğe iki mikrolitre FC bloğu ekleyin. Daha sonra numuneleri oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatırın. Her tüpe antikor ekleyin ve karanlıkta 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın.
Hücreleri iki mililitre soğuk PBS ve santrifüj ile 300 kez G ve dört santigrat derecede yıkayın. Son olarak, 200 mikrolitre PBS'de yeniden dirildi. Süspansiyonu her biri 100 mikrolitre olmak üzere iki tüpe bölün ve beş mikrolitre hücre canlılık lekesi ekleyin.
Negatif kontrol tüpüne uygun spesifik NSP inhibitörü ekleyin ve numuneyi karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya bırakın. Örneğe PBS ekleyin ve 40 mikron filtreden temiz bir FACS tüpüne filtreleyin. Muhabiri negatif kontrol örneğine ekleyin ve hafifçe girdaplayın.
Bu özel inhibitörle inkübe edilmiş hücreleri edinmeye başlayın ve gerekirse, kapıları ve muhabir PMT voltajlarını hafifçe ayarlayın. Membran bağlı proteaz aktivitesi nedeniyle bir oranı kabul etmek için donördeki değişiklikleri kaydetmek için, her tüpten her beş ila 10 dakikada bir 1000 nötrofil kaydedin. FRET oranını, donörün kapılı uygulanabilir tek nötrofiller üzerinde ölçülen numuneler için alıcı kanal değerlerine bölerek hesaplayın.
Nötrofillerin 100 mikromolar Sivilestat ile önceden inkübe edilmiş veya muhabir NEmo-2 ilavesinden önce tedavi edilmeden bırakılan görüntüleri burada gösterilmiştir. Nükleer sinyal nötrofilleri karakteristiklerine göre tanımlamak için kullanıldı çekirdekler ve yatırım getirisi manuel olarak seçildi. Balgam nötrofil oranını kabul eden donör çizildi.
Her nokta bir yatırım getirisinin ortalamasını temsil eder. Akış sitometrisi gating, balgam nötrofillerini ayırt etmeyi ve incelemeyi mümkün kılar. MFI dağılımı sıfır ve 10 dakika olarak muhabir ilavesi sonrasında gözlendi.
1000 balgam nötrofil için ortalama donör ve kabul eden MFI değerleri hesaplandı. D/A oranı ilk artıştan sonra bir platoya ulaştı. Sağlıklı donör balgam indüksiyonu mükemmellik öncesi biraz pratik gerektirir.
Balgam sekenden önce rahatlamayı ve aerosolü 10 ila 15 dakika solumeyi unutmayın. Ek olarak, balgam hücrelerini her zaman buz üzerinde tutar ve balgam sürücüden sonra mümkün olan en kısa sürede işler. Yüzeye bağlı proteaz aktivitesinin çocuklarda erken akciğer hasarı ve erişkin CF hastalarında akciğer hastalığının şiddeti ile ilişkili olduğunu bulduk.
Bu nedenle, bu yöntemler birlikte nötrofilik hava yolu hastalıklarında erken inflamasyon biyobelirteçleri olarak proteazların araştırılmasını sağlar.
