La nostra sonda e i nostri protocolli FRET consentono la quantificazione rapida e sensibile dell'attività libera e legata alla superficie dell'elastasi e del catespin G nell'espettorato da pazienti con malattie delle vie aeree neutrofile. Questi metodi, rendono possibile esplorare diversi aspetti della fisiopatologia delle proteasi. Le misurazioni del lettore di lastre consentono proiezioni di grandi dimensioni.
La microscopia confocale visualizza l'attività enzimatica con la soluzione subcellulare. Mentre la citometria a flusso, consente la fenotipizzazione a singola cellula e la quantificazione dell'attività proteasi in modo personalizzato. Questa tecnica può essere estesa a diverse malattie delle vie aeree come fibrosi cistica, bronchectasi o BPCO.
E può essere adattato a diversi BioSamples come sangue o alveola bronchiale lavash o campioni di topi. Prima di iniziare la procedura di induzione dell'espettorato, inalare 200 microgrammi degli antagonisti del recettore beta 2 salbutamolo. Successivamente, inalare la soluzione ipertonica 6% salina per 15 minuti utilizzando un nebulizzatore.
Raccogliere l'espettorato espettorato in una piastra di Petri. Separare i grumi di muco dalla saliva in una piastra di Petri con l'aiuto di una punta di pipetta. Pesare il muco, quindi aggiungere quattro parti di volume per peso del 10%Sputolysin e PBS all'espettorato.
Incubare la miscela a temperatura ambiente su uno shaker a dondolo per 15 minuti per sciogliere il muco. Temprare la reazione aggiungendo un millilitro di PBS freddo per ogni millilitro del 10%Sputolysin. Pipettare la miscela per ottenere una soluzione omogenea.
Filtrare la miscela attraverso un colino a celle in nylon da 100 micron in un tubo da 50 millilitri. Ripetere il passaggio di filtrazione attraverso un colino da 40 micron, quindi centrifugare per 10 minuti a 300 volte G a quattro gradi Celsius. Trasferire il supernatante in un tubo fresco e conservarlo sul ghiaccio.
Rimorsi delicatamente il pellet cellulare in 500 microlitri di PBS freddo e posizionare sul ghiaccio. Scongelare gli enzimi sul ghiaccio e impostare una curva standard enzimatica come descritto nel manoscritto testuale. Parallelamente alla preparazione standard, diluire i campioni di espettorato nel buffer di attivazione.
Sul lettore di piastre, impostare la lunghezza d'onda di eccitazione per la sonda NE FRET da NEmo-1 a 354 nanometri e la lunghezza d'onda di emissione a 400 nanometri per donatore e 490 nanometri per accettore. Per la sonda CG FRET sSam impostare la lunghezza d'onda di eccitazione a 405 nanometri e l'emissione a 485 nanometri per donatore e 580 nanometri per accettore. Aggiungere 40 microlitri di campioni, standard o spazi vuoti nei pozzi di una piastra nera a mezza area da 96 poggia-porsi e aggiungere il mix principale.
Avviare il lettore di piastre e registrare l'aumento del rapporto donatore-accettore dopo ogni 60-90 secondi per almeno 20 minuti, o fino a quando l'aumento del segnale raggiunge un plateau. Esportare i dati e calcolare il rapporto donatore/accettore dividendo l'RFU donatore per l'accettore RFU per ogni punto di tempo e campione. Quindi calcolare la media del rapporto donatore-accettore e la deviazione standard.
Determinare la pendenza all'interno della crescita lineare del donatore alla variazione del rapporto accettore. Per ogni misurazione, resospend 30.000 cellule di espettorato in un volume di 50 microlitri di PBS in un tubo da 1,5 millilitri. Incubare le cellule dell'espettorato con uno specifico inibitore come controllo negativo e un enzima appropriato come controllo positivo per 10 minuti a temperatura ambiente.
Aggiungere 50 microlitri di PBS contenenti reporter FRET e una macchia nucleare ad ogni tubo per ottenere una concentrazione finale di 2 micromolari. Incubare la miscela a temperatura ambiente per 10-20 minuti. Dissetare la reazione aggiungendo 100 microlitri di PBS ghiacciato e posizionare i campioni sul ghiaccio.
Citospin la miscela su vetrine di microscopia. Quindi asciugare all'aria e fissare le celle con ghiaccio freddo 10% metanolo per 10 minuti. Dopo la fissazione, asciugare all'aria e montare il campione con un mezzo di montaggio appropriato.
Cattura le immagini usando un microscopio confocale. Immagine di almeno 100 celle per condizione per statistiche conclusive. Rimescolare 1 milione di cellule in 100 microlitri di PBS in un tubo inferiore rotondo in polistirolo FACS a cinque millilitri e posizionare il tubo sul ghiaccio.
Aggiungere due microlitri di blocco FC a ciascun campione. Quindi incubare i campioni per cinque minuti a temperatura ambiente. Aggiungere anticorpi ogni tubo e incubare sul ghiaccio al buio per 30 minuti.
Lavare le cellule con due millilitri di PBS freddo e centrifuga a 300 volte G e quattro gradi Celsius. Infine, resuspend in 200 microlitri di PBS. Dividere la sospensione in due tubi, 100 microlitri ciascuno e aggiungere cinque microlitri di macchia di vitalità cellulare.
Aggiungere un inibitore NSP specifico appropriato al tubo di controllo negativo e incubare il campione per 10 minuti a temperatura ambiente al buio. Aggiungere PBS al campione e filtrarlo attraverso un filtro da 40 micron in un tubo FACS pulito. Aggiungere il reporter al campione di controllo negativo e vortice delicatamente.
Inizia ad acquisire cellule incubate con questo specifico inibitore e, se necessario, regola leggermente i cancelli e le tensioni dei PMT reporter. Per registrare i cambiamenti nel donatore per accettare un rapporto dovuto all'attività proteasi legata alla membrana, registrare 1000 neutrofili da ogni tubo, ogni cinque-10 minuti. Calcola il rapporto FRET dividendo il donatore per i valori del canale accettore per i campioni misurati sui singoli neutrofili vitali gated.
Immagini di neutrofili pre incubati con 100 micromolari Sivilestat o lasciati non trattati prima dell'aggiunta del reporter NEmo-2 sono mostrati qui. Il segnale nucleare è stato utilizzato per identificare i neutrofili in base alle loro caratteristiche nuclei segmentati e il ROI è stato selezionato manualmente. Il donatore per accettare un rapporto di neutrofili dell'espettorato è stato tracciato.
Ogni punto rappresenta la media di un ROI. La ghiandolazione citometrica a flusso consente di discriminare e studiare i neutrofili dell'espettorato. La distribuzione delle IFM a zero e 10 minuti è stata osservata dopo l'aggiunta del reporter.
Sono stati calcolati i valori medi delle IFM donatori e accettori per 1000 neutrofili dell'espettorato. Il rapporto D/A ha raggiunto un plateau dopo un aumento iniziale. L'induzione dell'espettorato dei donatori sani richiede un po 'di pratica prima della perfezione.
Ricorda di rilassarti e di respirare l'aerosol per 10-15 minuti prima dell'espettorazione. Inoltre, mantiene sempre le cellule di espettorato sul ghiaccio e le elabora il prima possibile dopo l'espettorazione. La Corte ha riscontrato che l'attività proteasi legata alla superficie è correlata ai danni polmonari precoci nei bambini e alla gravità della malattia polmonare nei pazienti affetti da CF adulti.
Pertanto, insieme, questi metodi consentono l'esplorazione delle proteasi come biomarcatori di infiammazione precoce nelle malattie delle vie aeree neutrofile.
