الإشريكية القولونية هي البكتيريا الأكثر شيوعا سلبية الغرام المسببة لالتهاب السحايا حديثي الولادة. يحدث التهاب السحايا البكتيري الوليدي يبدأ بحتا مع البكتيريا ومن ثم البكتيريا في الدم تخترق حاجز الدم في الدماغ للتسبب في التهاب السحايا. العدلات هي خط الدفاع الأول ضد العدوى البكتيرية.
أثناء الغزو البكتيري ، تطلق العدلات النشطة ROS. يمثل ROS الآليات الرئيسية للبكتيريا للخلايا المضيفة لتدمير مسببات الأمراض الغازية. قياس إنتاج ROS في العدلات هو طريقة مفيدة لبدء دفاع المضيف أثناء التفاعل بين البكتيريا والمضيف.
تأخذ مستعمرة بكتيرية واحدة من لوحة مع ماصة معقمة ووضعها في خمسة ملليلتر الدماغ القلب ضخ المتوسطة التي تحتوي على ريفامبيسين في قارورة مقعرة. احتضان الثقافة البكتيرية في 37 درجة مئوية ، مع 90 دورة في الدقيقة لمدة 17 ساعة في شاكر الحضانة. طرد عينات الدم المحيطية في 2000 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق.
بعد الطرد المركزي، تنقسم عينات الدم إلى ثلاث طبقات. من الأسفل إلى الأعلى، طبقة خلايا الدم الحمراء، طبقة خلايا الدم البيضاء، وطبقة البلازما. يستنشق طبقة خلايا الدم البيضاء إلى أنبوب جديد مع ماصة معقمة.
إضافة ثلاثة أضعاف خلية الدم الحمراء تحلل العازلة. يمزج المزيج جيدا، ويوضع في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. الطرد المركزي الأنبوب في 2000 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق.
يستنشق supernatant تماما وتجاهل. كرر إجراء التحلل لخلايا الدم الحمراء مرة أو مرتين ، حتى تتحول الرواسب إلى اللون الأبيض. غسل الخلايا عن طريق إعادة تعليق الرواسب مع اثنين من برنامج تلفزيوني ملليلتر.
ثم طرد أنبوب في 1000 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق. Resuspend الرواسب مع 15 microliter precode العازلة فرز الخلايا المغناطيسية ل15 مليون خلية. إضافة 15 ميكرولتر الميكروبات المغناطيسية وتخلط جيدا.
احتضان الخليط في أربع درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. في ظل الظروف العادية ، يكون لدى الإنسان البالغ حوالي 4 إلى 10000 خلية دم بيضاء لكل دم ميكرولتر. وبالتالي فإن تكلفة إجمالي خلايا الدم البيضاء في خمسة ملليلتر الدم المحيطي البشري، ما يقرب من 50 مليون.
و50 حبة مغناطيسية ميكرولتر في 15 ميكرولتر المغناطيسي الفرز العازلة يكفي. النسبة الطبيعية من العدلات هي 50 إلى 70٪ من إجمالي خلايا الدم البيضاء. لذلك يمكن الحصول على حوالي 10 مليون العدلات من الدم خمسة ملليلتر.
اغسل الخلايا بإضافة حاجزين للفرز المغناطيسي بالملليلتر، لكل 10 ملايين خلية إلى الأنبوب، وأجهزة الطرد المركزي عند أربع درجة مئوية، 1، 200 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق. تجميع العمود المغناطيسي وفصل الرف. تجاهل supernatant تماما، وإعادة إنفاق الرواسب مع 500 ميكرولتر العازلة الفرز المغناطيسي لمدة تصل إلى 100 مليون خلية.
شطف العمود مع ثلاثة ملليلتر العازلة الفرز المغناطيسي. تطبيق تعليق الخلية على العمود للسماح العدلات المسمى من قبل الخرز المغناطيسي، تعلق على العمود. غسلها قبالة خلايا محددة غير محددة عن طريق إضافة ثلاثة ملليلتر العازلة لمدة ثلاث مرات، مرة واحدة خزان العمود فارغ في كل مرة.
إزالة العمود من الفاصل المغناطيسي، ووضعها في أنبوب جديد. إضافة خمسة ملليلتر المخزن المؤقت الفرز المغناطيسي في العمود. دفع خارج الخلايا المسماة المغناطيسي باستخدام المكبس.
الطرد المركزي الأنبوب في 1, 200 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق. يستنشق supernatant تماما، وإعادة إنفاق الرواسب مع وسيط واحد ثقافة ملليلتر. تحديد رقم الخلية باستخدام عداد.
ضبط تركيز الخلية إلى 2 مليون لكل ملليلتر في وسط الثقافة الذي يحتوي على مسبار مضان DHE. ضع العدلات في الحاضنة لمدة 30 دقيقة لتحميل مسبار DHE. تخصيص تعليق الخلية إلى لوحة صغيرة سوداء 96 جيدا مع 200 ميكرولتر لكل بئر.
قم بتشغيل قارئ اللوحة الدقيقة. تعيين درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية، واختيار وضع القراءة مضان، نوع القراءة الحركية، تعيين الطول الموجي الفلوري. اختر تنسيق اللوحة.
تحديد منطقة القراءة. قياس كثافة الفلورسينس كل خمس دقائق لمدة ساعة. يهز لوحة لمدة ثلاث ثوان قبل كل قراءة.
أخرج اللوحة الصغيرة من الحاضنة أضف سلالات PMA أو E44 مع ثلاثة تكرارات. وضع لوحة في قارئ microplate، اضغط على زر البدء لبدء المقايسة على الفور.
باستخدام مخطط البروتوكول في هذه المقالة ، تم عزل العدلات عن الدم المحيطي البشري ، وتم تحميلها بمسبار مضان DHE. من خلال إضافة PMA ، أظهرت ROS داخل الخلايا في العدلات ، زيادة كبيرة من 20 إلى 40 دقيقة ، ووصلت إلى ذروتها في 60 دقيقة. ولكن أعتقد أن سلالات E44 ، وإنتاج روس يحدث على الفور ويزيد من الوقت بشكل يعتمد عليه.
التعبير عن ROS الناجمة عن سلالة E44 مماثلة لتلك التي تسببها PMA. الكشف عن إنتاج روس في العدلات قد تسهم في مزيد من الدراسة للآليات مبيد للجراثيم من العدلات. في هذا البروتوكول، ونحن نقدم وسيلة أسهل للكشف عن إنتاج ROS في العدلات بطريقة في الوقت الحقيقي.
يمكن أيضا استخدام الطريقة البسيطة لمراقبة إنتاج ROS في أنواع خلايا المضيفين الآخرين أثناء التفاعلات بين البكتيريا المضيفة.
