Escherichia Coli é a bactéria gram-negativa mais comum que causa meningite neonatal. A ocorrência de meningite bacteriana neonatal começa puramente com a bacteremia e, em seguida, as bactérias no sangue penetram através da barreira cerebral sanguínea para causar meningite. Neutrófilos são a primeira linha de defesa contra as infecções bacterianas.
Durante a invasão bacteriana, os neutrófilos ativos liberam ROS. A ROS representa os principais mecanismos bactericidais das células hospedeiras para destruir os patógenos invasores. Medir a produção de ROS em neutrófilos é um método útil para iniciar a defesa do hospedeiro durante a interação bactérias-hospedeiros.
Pegue uma única colônia bacteriana da placa com uma pipeta estéril e coloque-a em um meio de infusão cérebro-coração de cinco mililitros contendo Rifampicina em um frasco côncavo. Incubar a cultura bacteriana em 37 centígrados, com 90 RPM por 17 horas no shaker de incubação. Centrifugar as amostras de sangue periférico a 2000 RPM por cinco minutos.
Após centrífuga, as amostras de sangue são divididas em três camadas. De baixo para cima, a camada de glóbulos vermelhos, a camada de glóbulos brancos e a camada de plasma. Aspire a camada de glóbulos brancos em um novo tubo com uma pipeta estéril.
Adicione três vezes o tampão de lise de glóbulos vermelhos. Misture bem a mistura e coloque em temperatura ambiente por cinco minutos. Centrifugar o tubo a 2000 RPM por cinco minutos.
Aspire completamente o supernatante e descarte. Repita o procedimento de lise de glóbulos vermelhos por uma ou duas vezes, até que os sedimentos se adoeçam. Lave as células suspendendo o sedimento com dois mililitros pbs.
Em seguida, centrifugar o tubo a 1000 RPM por cinco minutos. Resuspense o sedimento com 15 microliter precode-cell sorting buffer para 15 milhões de células. Adicione 15 microesferas magnéticas microfeitiças e misture bem.
Incubar a mistura a quatro centígrados por 30 minutos. Em condições normais, o ser humano adulto tem cerca de 4 a 10.000 glóbulos brancos por sangue microliter. Assim, o custo total de glóbulos brancos em cinco mililitros de sangue periférico humano, quase menos de 50 milhões.
E 50 contas magnéticas de microliter em 15 tampão magnético microliter é suficiente. A porcentagem normal dos neutrófilos é de 50 a 70% do total de glóbulos brancos. Assim, cerca de 10 milhões de neutrófilos podem ser obtidos a partir de cinco mililitros de sangue.
Lave as células adicionando dois amortecedores magnéticos mililitros, por 10 milhões de células ao tubo, e centrífuga a quatro centícaros, 1.200 RPM por 10 minutos. Monte a coluna magnética e a prateleira de separação. Descarte o supernascer completamente, e resuspenque os sedimentos com 500 tampão de triagem magnética microliter para até 100 milhões de células.
Enxágüe a coluna com três mililitros de tampão magnético. Aplique a suspensão celular na coluna para permitir que os neutrófilos rotulados pelas contas magnéticas, anexadas à coluna. Lavei as células específicas não específicas adicionando três mililitros tampão por três vezes, uma vez que o reservatório da coluna está vazio cada vez.
Remova a coluna do separador magnético e coloque-a em um novo tubo. Adicione um tampão magnético de cinco mililitros na coluna. Empurre as células magnéticas rotuladas usando um êmbolo.
Centrifugar o tubo a 1.200 RPM por cinco minutos. Aspire completamente o supernaente, e resuspense o sedimento com um meio de cultura mililitro. Determine o número do celular com um contador.
Ajustou a concentração celular para 2 milhões por mililitro no meio de cultura contendo sonda de fluorescência DHE. Coloque os neutrófilos na incubadora por 30 minutos para carregar a sonda DHE. Aloque a suspensão celular para uma microplacão preta de 96 poços com 200 microliter por poço.
Ligue o leitor de microplacões. Defina a temperatura para 37 centígrados, escolha o modo de leitura da fluorescência, o tipo de leitura cinética, defina o comprimento de onda da fluorescência. Escolha o formato da placa.
Determine a área de leitura. Meça a intensidade da fluorescência a cada cinco minutos por uma hora. Agite a placa por três segundos antes de cada leitura.
Retire a microplaca da incubadora. Adicione cepas PMA ou E44 com três repetições. Coloque a placa no leitor de microplacões, pressione o botão iniciar para iniciar o ensaio imediatamente.
Usando o esboço do protocolo neste artigo, os neutrófilos foram isolados do sangue periférico humano, e carregados com sonda de fluorescência DHE. Adicionando PMA, ROS intracelular em neutrófilos, mostrou um aumento significativo de 20 para 40 minutos, e atingiu o pico em 60 minutos. Mas eu acho que a produção de E44 ocorre imediatamente e aumenta o tempo dependente.
A expressão de ROS causada pela cepa E44 é semelhante à causada pelo PMA. A detecção da produção de ROS em neutrófilos pode contribuir para o estudo mais aprofundado dos mecanismos bacteriocidas dos neutrófilos. Neste protocolo, fornecemos uma maneira mais fácil de detectar a produção de ROS em neutrófilos de forma em tempo real.
O método simples também poderia ser usado para monitorar a produção de ROS em outros tipos de células hospedeiras durante as interações hospedeira-bactérias.
