Escherichia Coli es la bacteria gram-negativa más común que causa meningitis neonatal. La aparición de meningitis bacteriana neonatal comienza únicamente con la bacteremia y luego las bacterias en la sangre penetran a través de la barrera hematoencefálica para causar meningitis. Los neutrófilos son la primera línea de defensa contra las infecciones bacterianas.
Durante la invasión bacteriana, los neutrófilos activos liberan ROS. ROS representa los principales mecanismos bacteriocidas de las células huésped para destruir los patógenos invasores. Medir la producción de ROS en neutrófilos es un método útil para iniciar la defensa del huésped durante la interacción bacteriana-huésped.
Tome una sola colonia bacteriana de la placa con una pipeta estéril y colóquela en un medio de infusión cerebro-corazón de cinco mililitros que contiene rifampicina en un matraz cóncavo. Incubar el cultivo bacteriano a 37 grados centígrados, con 90 RPM durante 17 horas en la incubadora. Centrífuga las muestras de sangre periférica a 2000 RPM durante cinco minutos.
Después de la centrífuga, las muestras de sangre se dividen en tres capas. Desde la parte inferior hasta la parte superior, la capa de glóbulos rojos, la capa de glóbulos blancos y la capa plasmática. Aspirar la capa de glóbulos blancos a un nuevo tubo con una pipeta estéril.
Agregue tres veces el tampón de lisis de los glóbulos rojos. Mezcle bien la mezcla y colóquelo a temperatura ambiente durante cinco minutos. Centrífuga el tubo a 2000 RPM durante cinco minutos.
Aspirar el sobrenadante por completo y descartar. Repita el procedimiento de lisis de los glóbulos rojos durante una o dos veces, hasta que los sedimentos se vuelvan blancos. Lave las células re-suspendiendo el sedimento con dos mililitros PBS.
A continuación, centrífuga el tubo a 1000 RPM durante cinco minutos. Resuspend el sedimento con 15 microlitros precodificar amortiguador de clasificación de células magnéticas para 15 millones de células. Agregue 15 microperlas magnéticas de microlitro y mezcle bien.
Incubar la mezcla a cuatro grados centígrados durante 30 minutos. En condiciones normales, el ser humano adulto tiene entre cuatro y 10.000 glóbulos blancos por sangre microlitro. Así que el costo del total de glóbulos blancos en sangre periférica humana de cinco mililitros, casi menos de 50 millones.
Y 50 cuentas magnéticas de microlitro en 15 microlitros de clasificación magnética es suficiente. El porcentaje normal de neutrófilos es del 50 al 70% del total de los glóbulos blancos. Así que alrededor de 10 millones de neutrófilos se pueden obtener de sangre de cinco mililitros.
Lave las células añadiendo dos mililitros de clasificación magnética, por cada 10 millones de células al tubo, y centrífuga a cuatro grados centígrados, 1.200 RPM durante 10 minutos. Monte la columna magnética y el estante de separación. Deseche el sobrenadante por completo, y resuspend los sedimentos con 500 amortiguadores de clasificación magnética de microlitro para hasta 100 millones de células.
Enjuague la columna con un búfer de clasificación magnética de tres mililitros. Aplique la suspensión celular en la columna para permitir que los neutrófilos etiquetados por las cuentas magnéticas, unidas a la columna. Lávese las celdas específicas no específicas añadiendo tres mililitros durante tres veces, una vez que el depósito de columnas esté vacío cada vez.
Retire la columna del separador magnético y colóquela en un tubo nuevo. Agregue cinco mililitros de clasificación magnética en la columna. Expulse las células etiquetadas magnéticas usando un émbolo.
Centrífuga el tubo a 1.200 RPM durante cinco minutos. Aspirar el sobrenadante por completo, y resuspend el sedimento con un medio de cultivo mililitro. Determine el número de celda con un contador.
Se ha ajustado la concentración celular a 2 millones por mililitro en el medio de cultivo que contiene la sonda de fluorescencia DHE. Coloque los neutrófilos en la incubadora durante 30 minutos para cargar la sonda DHE. Asigne la suspensión celular a una microplaca negra de 96 pozos con 200 microlitros por pozo.
Encienda el lector de microplacas. Ajuste la temperatura a 37 grados centígrados, elija el modo de lectura de fluorescencia, el tipo de lectura cinética, establezca la longitud de onda de fluorescencia. Elija el formato de placa.
Determine el área de lectura. Mida la intensidad de fluorescencia cada cinco minutos durante una hora. Agitar el plato durante tres segundos antes de cada lectura.
Saca la microplaca de la incubadora. Añadir cepas PMA o E44 con tres repeticiones. Coloque la placa en el lector de microplacas, pulse el botón de inicio para comenzar el ensayo inmediatamente.
Usando el esquema del protocolo en este artículo, los neutrófilos fueron aislados de la sangre periférica humana, y cargados con sonda de fluorescencia DHE. Al agregar PMA, ros intracelular en neutrófilos, mostró un aumento significativo de 20 a 40 minutos, y alcanzó su pico en 60 minutos. Pero creo que las cepas E44, la producción de ROS se produce inmediatamente y aumenta el tiempo de forma dependiente.
La expresión de ROS causada por la cepa E44 es similar a la causada por PMA. La detección de la producción de ROS en neutrófilos puede contribuir al estudio posterior de los mecanismos bacteriócidas de los neutrófilos. En este protocolo, proporcionamos una manera más fácil de detectar la producción ros en neutrófilos de una manera en tiempo real.
El método simple también podría utilizarse para monitorear la producción de ROS en otros tipos de células anfitrionas durante las interacciones entre el huésped y las bacterias.
