Escherichia Coli ist die häufigste gramnegative Bakterien verursacht neonatale Meningitis. Das Auftreten der neonatalen bakteriellen Meningitis beginnt rein mit der Bakteriämie und dann dringen die Bakterien im Blut durch die Blut-Hirn-Schranke, um Meningitis zu verursachen. Neutrophile sind die erste Verteidigungslinie gegen die bakteriellen Infektionen.
Während der bakteriellen Invasion setzen die aktiven Neutrophilen ROS frei. ROS stellt die wichtigsten bakteriziden Mechanismen von Wirtszellen dar, um die eindringenden Krankheitserreger zu zerstören. Die Messung der Produktion von ROS in Neutrophilen ist eine nützliche Methode, um die Abwehr des Wirts während der Bakterien-Wirt-Interaktion zu starten.
Nehmen Sie eine einzelne Bakterienkolonie mit einer sterilen Pipette von der Platte und legen Sie sie in ein fünf Milliliter Gehirn-Herz-Infusionsmedium, das Rifampicin enthält, in einen konkaven Kolben. Inkubieren Sie die Bakterienkultur bei 37 Grad Celsius, mit 90 Umdrehungen pro Minute für 17 Stunden im Inkubationsshaker. Zentrifuge die peripheren Blutproben bei 2000 U/min für fünf Minuten.
Nach der Zentrifuge werden die Blutproben in drei Schichten unterteilt. Von unten nach oben, die rote Blutkörperchen Schicht, die weiße Blutkörperchen Schicht, und die Plasmaschicht. Die weißen Blutkörperchen schichten zu einem neuen Rohr mit einer sterilen Pipette.
Fügen Sie dreifachen roten Blutkörperchen-Lysepuffer hinzu. Mischen Sie die Mischung gründlich, und legen Sie bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 2000 U/min für fünf Minuten.
Aspirieren Sie den Überstand vollständig und entsorgen. Wiederholen Sie den Lyse-Vorgang der roten Blutkörperchen ein oder zwei Mal, bis die Sedimente weiß werden. Waschen Sie die Zellen, indem Sie das Sediment mit zwei Milliliter PBS wieder aufhängen.
Dann zentrifugieren Sie das Rohr bei 1000 U/min für fünf Minuten. Setzen Sie das Sediment mit 15 Mikroliter vorcodieren magnetischen Zellsortierpuffer für 15 Millionen Zellen. 15 Mikroliter magnetische Mikroperlen hinzufügen und gründlich mischen.
Inkubieren Sie die Mischung bei vier Grad Celsius für 30 Minuten. Unter normalen Bedingungen hat der erwachsene Mensch etwa vier bis zehn 000 weiße Blutkörperchen pro Mikroliter Blut. So die Kosten für die gesamten weißen Blutkörperchen in fünf Milliliter menschliches peripheres Blut, fast weniger als 50 Millionen.
Und 50 Mikroliter magnetische Perlen in 15 Mikroliter magnetischen Sortierpuffer ist genug. Der normale Prozentsatz der Neutrophilen beträgt 50 bis 70% der gesamten weißen Blutkörperchen. So können etwa 10 Millionen Neutrophile aus fünf Milliliter Blut gewonnen werden.
Waschen Sie die Zellen, indem Sie zwei Milliliter magnetischen Sortierpuffer, pro 10 Millionen Zellen in die Röhre und Zentrifuge bei vier Zentigrade, 1, 200 U/min für 10 Minuten. Montieren Sie die Magnetsäule und das Trennregal. Entsorgen Sie den Überstand vollständig und setzen Sie die Sedimente mit 500 Mikroliter magnetischen Sortierpuffer für bis zu 100 Millionen Zellen wieder auf.
Spülen Sie die Säule mit drei Milliliter magnetischen Sortierpuffer. Tragen Sie die Zellsuspension auf die Säule auf, damit die Neutrophilen, die durch die magnetischen Perlen gekennzeichnet sind, an der Säule befestigt sind. Wird die unspezifischen spezifischen Zellen abgewaschen, indem dreimal drei Milliliter Puffer hinzugefügt werden, sobald das Säulenreservoir jedes Mal leer ist.
Entfernen Sie die Säule aus dem magnetischen Separator, und legen Sie sie in ein neues Rohr. Fügen Sie der Spalte einen magnetischen Sortierpuffer mit fünf Millilitern hinzu. Drücken Sie die magnetisch beschrifteten Zellen mit einem Kolben aus.
Zentrifugieren Sie das Rohr bei 1, 200 U/min für fünf Minuten. Den Überstand vollständig ansaugen und das Sediment mit einem Milliliter-Kulturmedium wieder aufsetzen. Bestimmen Sie die Zellennummer mit einem Zähler.
Die Zellkonzentration im Kulturmedium, das die DHE-Fluoreszenzsonde enthält, wurde auf 2 Millionen pro Milliliter angepasst. Legen Sie die Neutrophilen 30 Minuten lang in den Inkubator, um die DHE-Sonde zu laden. Ordnen Sie die Zellsuspension einer 96-well schwarzen Mikroplatte mit 200 Mikroliter pro Brunnen zu.
Schalten Sie den Mikroplattenleser ein. Stellen Sie die Temperatur auf 37 Grad Celsius, wählen Sie Fluoreszenz-Lesemodus, kinetische Leseart, die Fluoreszenz-Wellenlänge. Wählen Sie das Plattenformat aus.
Bestimmen Sie den Lesebereich. Messen Sie die Fluoreszenzintensität alle fünf Minuten für eine Stunde. Schütteln Sie die Platte drei Sekunden vor jeder Lesung.
Nehmen Sie die Mikroplatte aus dem Inkubator. Fügen Sie PMA- oder E44-Stämme mit drei Wiederholungen hinzu. Legen Sie die Platte in den Mikroplattenleser, drücken Sie die Starttaste, um den Test sofort zu beginnen.
Unter Verwendung der Protokollumriss in diesem Artikel wurden die Neutrophilen aus dem menschlichen peripheren Blut isoliert und mit der Fluoreszenzsonde DHE beladen. Durch Zugabe von PMA, intrazelluläre ROS in Neutrophilen, zeigte eine signifikante Zunahme von 20 auf 40 Minuten, und erreichte Den höchsten Stand bei 60 Minuten. Aber ich denke, E44 Stämme, die ROS-Produktion erfolgt sofort und erhöht die Zeit abhängig.
Die Expression von ROS, die durch E44-Stamm verursacht wird, ähnelt der von PMA verursachten. Der Nachweis der ROS-Produktion bei Neutrophilen kann zur weiteren Untersuchung der bakteriziden Mechanismen von Neutrophilen beitragen. In diesem Protokoll bieten wir eine einfachere Möglichkeit, die ROS-Produktion in Neutrophilen in Echtzeit zu erkennen.
Die einfache Methode könnte auch verwendet werden, um die ROS-Produktion in anderen Wirtszellentypen während der Wirts-Bakterien-Wechselwirkungen zu überwachen.
