대장균은 신생아 뇌막염을 유발하는 가장 흔한 그램 음성 박테리아입니다. 신생아 세균성 뇌막염의 발생은 순전히 세균염으로 시작하고 혈액내 박테리아가 뇌막염을 일으키는 원인이 되기 위하여 혈액 두뇌 장벽을 통해 침투합니다. 호중구는 세균 감염에 대한 방어의 첫 번째 라인입니다.
세균성 침략 도중, 활성 호중구는 ROS를 풀어 놓습니다. ROS는 침입병원균을 파괴하는 숙주 세포의 주요 박테리오시달 메커니즘을 나타낸다. 호중구에서 ROS의 생산을 측정하는 것은 박테리아 호스트 상호 작용 중에 호스트의 방어를 시작하는 데 유용한 방법입니다.
멸균 파이펫으로 접시에서 하나의 세균 식민지를 가지고 오목 한 플라스크에 리팜피신을 포함하는 다섯 밀리리터 브레인 - 심장 주입 매체에 넣어. 세균 배양을 37센티미터에서 배양하고, 인큐베이션 셰이커에서 17시간 동안 90RPM을 증식합니다. 5 분 동안 2000 RPM에서 말초 혈액 샘플을 원심 분리합니다.
원심분리기 후에, 혈액 견본은 3개의 층으로 나뉩니다. 아래에서 위쪽으로, 적혈구 층, 백혈구 층 및 혈장 층. 백혈구층을 멸균 파이펫으로 새로운 튜브로 흡입합니다.
적혈구 리시스 버퍼를 3배 추가합니다. 혼합물을 철저히 섞고 실온에서 5분간 놓습니다. 2000 RPM에서 5분 동안 튜브를 원심분리합니다.
슈퍼 상체를 완전히 흡인하고 폐기하십시오. 퇴적물이 하얗게 변할 때까지 적혈구의 용해 절차를 하나 또는 두 번 반복합니다. 2밀리리터 PBS로 퇴적물을 다시 중단하여 세포를 씻으라.
그런 다음 튜브를 1000 RPM에서 5분 동안 원심분리합니다. 15 마이크로리터 프리코드 자기 세포 선별 버퍼로 퇴적물을 1,500만 개의 세포에 재부착한다. 마이크로리터 마그네틱 마이크로비드 15개에 넣고 잘 섞어줍니다.
혼합물을 4센티미터에서 30분 동안 배양합니다. 정상적인 조건하에서, 성인 인간은 마이크로 리터 혈액 당 대략 4 10, 000 백혈구가 있습니다. 따라서 5밀리리터 인간의 말초 혈액에 있는 총 백혈구의 비용은 거의 5천만 미만입니다.
그리고 15 마이크로 리터 자기 선별 버퍼에서 50 마이크로 리터 자기 구슬이 충분하다. 호중구의 정상 비율은 전체 백혈구의 50~70%이다. 따라서 약 1,000만 마리의 호중구가 5밀리리터 혈액에서 얻을 수 있습니다.
튜브에 1,000만 개의 세포당 2밀리리터 자기 선별 버퍼를 추가하고 원심분리기를 4센티미터, 1, 200 RPM에서 10분 동안 추가하여 세포를 세척합니다. 자기 컬럼을 조립하고 선반을 분리합니다. 상체를 완전히 폐기하고 최대 1억 개의 셀에 대해 500 마이크로리터 자기 선별 버퍼로 퇴적물을 다시 중단합니다.
3밀리리터 자기 선별 버퍼로 컬럼을 헹구는 다. 열에 부착된 자기 구슬에 의해 표지된 호중구를 허용하도록 셀 서스펜션을 열에 적용합니다. 매번 기둥 저장소가 비어 있으면 3밀리리터 버퍼를 세 번 추가하여 비특이적 특이적 셀을 씻어낸다.
자기 분리기에서 컬럼을 제거하고 새 튜브에 넣습니다. 열에 5밀리리터 자기 선별 버퍼를 추가합니다. 플런저를 사용하여 마그네틱 표지된 세포를 밀어내보아.
1, 200 RPM에서 5분 동안 튜브를 원심분리합니다. 수퍼내를 완전히 흡인시키고, 1밀리리터 배양 배지로 퇴적물을 재보편하게 한다. 카운터를 사용하여 셀 번호를 결정합니다.
DHE 형광 프로브를 함유한 배양 배지에서 밀리리터당 세포 농도를 2백만 으로 조정하였다. 호중구를 인큐베이터에 30분 간 배치하여 DHE 프로브를 로드합니다. 셀 서스펜션을 96웰의 검정 마이크로플레이트에 잘 200 마이크로리터가 할당합니다.
마이크로 플레이트 판독기를 켭니다. 온도를 37센티미터로 설정하고, 형광 읽기 모드, 운동 읽기 유형을 선택하고, 형광 파장을 설정합니다. 플레이트 형식을 선택합니다.
판독 영역을 결정합니다. 1시간 동안 5분마다 형광 강도를 측정합니다. 각 읽기 전에 3 초 동안 접시를 흔들어.
인큐베이터에서 마이크로 플레이트를 꺼내십시오. 세 번의 반복으로 PMA 또는 E44 균주를 추가합니다. 마이크로 플레이트 판독기에 접시를 넣고 시작 버튼을 눌러 즉시 분석서를 시작합니다.
이 문서에서 프로토콜 개요를 사용하여 호중구는 인간의 말초 혈액으로부터 분리되고 형광 프로브 DHE로 로드되었습니다. PMA를 추가함으로써, 호중구에 있는 세포내 ROS는, 20에서 40 분으로 중요한 증가를 보여주었고, 60 분에 피크에 도달했습니다. 그러나 나는 E44 균주, ROS 생산이 즉시 발생하고 의존적으로 시간을 증가 생각합니다.
E44 균주에 의한 ROS의 발현은 PMA에 의한 것과 유사합니다. 호중구에서 ROS 생산의 검출은 호중구의 박테리오시달 메커니즘의 추가 연구에 기여할 수 있습니다. 이 프로토콜에서, 우리는 실시간으로 호중구에서 ROS 생산을 검출하는 쉬운 방법을 제공합니다.
간단한 방법은 또한 호스트 박테리아 상호 작용 도중 그밖 호스트 세포 모형에 있는 ROS 생산을 감시하기 위하여 이용될 수 있었습니다.
