Escherichia Coli, yenidoğan menenjite neden olan en yaygın gram negatif bakteridir. Yenidoğan bakteriyel menenjitin oluşumu tamamen bakteriyemi ile başlar ve daha sonra kandaki bakteriler menenjite neden olmak için kan beyin bariyerine nüfuz eder. Nötrofiller bakteriyel enfeksiyonlara karşı ilk savunma hattıdır.
Bakteri istilası sırasında, aktif nötrofiller ROS'yi serbest bırakır. ROS, istilacı patojenleri yok etmek için konak hücrelerin ana bakterisidal mekanizmalarını temsil eder. Nötrofillerde ROS üretimini ölçmek, bakteri-konak etkileşimi sırasında konağın savunmasına başlamak için yararlı bir yöntemdir.
Steril pipet ile plakadan tek bir bakteri kolonisi alın ve içbükey bir şişede Rifampicin içeren beş mililitre Beyin-Kalp infüzyon ortamına koyun. Bakteri kültürünü 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın, kuluçka çalkalayıcıda 17 saat boyunca 90 RPM ile. Periferik kan örneklerini 2000 RPM'de beş dakika santrifüjleyin.
Santrifüjden sonra, kan örnekleri üç katmana ayrılır. Aşağıdan yukarıya, kırmızı kan hücreleri tabakası, beyaz kan hücreleri tabakası ve plazma tabakası. Beyaz kan hücreleri tabakasını steril pipetli yeni bir tüpe epire edin.
Üç kat kırmızı kan hücresi liziz tamponu ekleyin. Karışımı iyice karıştırın ve beş dakika boyunca oda sıcaklığına yerleştirin. Tüpü 2000 RPM'de beş dakika santrifüjleyin.
Süpernatantı tamamen aspire edin ve atın. Çökeltiler beyazlayıncaya kadar kırmızı kan hücrelerinin liziz prosedürünü bir veya iki kez tekrarlayın. Tortuyu iki mililitre PBS ile yeniden askıya alarak hücreleri yıkayın.
Sonra tüpü 1000 RPM'de beş dakika santrifüjleyin. Tortuyu 15 milyon hücre için 15 mikroliter önkodlu manyetik hücre sıralama tamponu ile yeniden biriktirin. 15 mikroliter manyetik mikrobead ekleyin ve iyice karıştırın.
Karışımı 30 dakika boyunca dört santigratta kuluçkaya yatırın. Normal koşullar altında, yetişkin insan mikroliter kan başına yaklaşık 4 ila 10.000 beyaz kan hücresine sahiptir. Yani beş mililitre insan periferik kanındaki toplam beyaz kan hücrelerinin maliyeti, neredeyse 50 milyondan az.
Ve 15 mikroliter manyetik ayırma tamponunda 50 mikroliter manyetik boncuk yeterlidir. Nötrofillerin normal yüzdesi toplam beyaz kan hücrelerinin% 50 ila 70'idir. Yani beş mililitre kandan yaklaşık 10 milyon nötrofil elde edilebilir.
Tüpe 10 milyon hücre başına iki mililitre manyetik sıralama tamponu ve 10 dakika boyunca dört santigrat, 1.200 RPM'de santrifüj ekleyerek hücreleri yıkayın. Manyetik sütunu ve ayırma rafını birleştirin. Süpernatantı tamamen atın ve tortuları 100 milyon hücreye kadar 500 mikroliter manyetik sıralama tamponu ile yeniden biriktirin.
Sütunu üç mililitre manyetik sıralama arabelleği ile durulayın. Sütuna bağlı manyetik boncuklar tarafından etiketlenmiş nötrofillere izin vermek için hücre süspansiyonunu sütuna uygulayın. Sütun rezervuarı her seferinde boşaldıktan sonra, üç kez üç mililitre arabellek ekleyerek spesifik olmayan belirli hücreleri yıkadı.
Sütunu manyetik ayırıcıdan çıkarın ve yeni bir tüpe koyun. Sütuna beş mililitre manyetik sıralama arabelleği ekleyin. Manyetik etiketli hücreleri bir piston kullanarak dışarı itin.
Tüpü 1,200 RPM'de beş dakika santrifüjleyin. Süpernatantı tamamen emiş ve tortuyu bir mililitre kültür ortamı ile yeniden canlandırmak. Sayaçla hücre numarasını belirleyin.
DHE floresan probu içeren kültür ortamında hücre konsantrasyonu mililitre başına 2 milyon olarak ayarlandı. DHE probını yüklemek için nötrofilleri 30 dakika boyunca inkübatöre yerleştirin. Hücre süspansiyonu, kuyu başına 200 mikroliter ile 96 kuyulu siyah bir mikro plakaya tahsis edin.
Mikro plaka okuyucuyu açın. Sıcaklığı 37 santigrat dereceye ayarlayın, floresan okuma modunu, kinetik okuma türünü seçin, floresan dalga boyunu ayarlayın. Plaka biçimini seçin.
Okuma alanını belirleyin. Bir saat boyunca her beş dakikada bir floresan yoğunluğunu ölçün. Her okumadan önce tabağı üç saniye sallayın.
Kuvözdeki mikro plakayı çıkar. Üç tekrarlı PMA veya E44 suşları ekleyin. Plakayı mikro plaka okuyucuya koyun, teste hemen başlamak için başlat düğmesine basın.
Bu makaledeki protokol ana hatlarını kullanarak, nötrofiller insan periferik kanından izole edildi ve floresan probu DHE ile yüklendi. Nötrofillerde hücre içi ROS PMA eklenerek 20 dakikadan 40 dakikaya kadar önemli bir artış gösterdi ve 60 dakikada zirveye ulaştı. Ancak E44'ün zorlandığını, ROS üretiminin hemen gerçekleştiğini ve zamanı bağımlı olarak artırdığını düşünüyorum.
E44 suşunun neden olduğu ROS ifadesi PMA'nın neden olduğu ifadeye benzer. Nötrofillerde ROS üretiminin tespiti, nötrofillerin bakteriyoidal mekanizmalarının daha fazla incelenmesine katkıda bulunabilir. Bu protokolde nötrofillerdeki ROS üretimini gerçek zamanlı olarak tespit etmenin daha kolay bir yolunu sunuyoruz.
Basit yöntem, konak bakteri etkileşimleri sırasında diğer konak hücre tiplerinde ROS üretimini izlemek için de kullanılabilir.
