يستخدم هذا البروتوكول لدراسة صفات النقل للتقاطعات الضيقة. باستخدام إمكانات التخفيف ، يمكنك قياس الانتقائية الدائمة والحصول على فهم للتقاطعات الضيقة في الأنسجة. هذه التقنية محددة وتستخدم الأنسجة الأصلية للدراسات الوظيفية للظهارة.
بالإضافة إلى ذلك ، تقيس هذه التقنية الخصائص الفسيولوجية في الوقت الفعلي للأنسجة ، وهو أمر مفيد للغاية. التحدي الأكبر هو إعداد الأنسجة. ممارسة هذه التقنية ، وكذلك مشاهدة هذا الفيديو سوف يساعد.
لتأكيد صلاحية الأنسجة هي أيضا خطوة مهمة. للبدء ، ضع الأجزاء المطلوبة من الأنسجة المعوية التي تم جمعها من الفئران القاضية كلودين 15 في محلول رينجر الفقاعي البارد وتقليم الدهون والنسيج الضام. بعد تقليم الدهون والأنسجة الضامة ، قم بقطع المرفقات المساريقية لفتح كل جزء طوليا ، ثم أعد الأجزاء إلى محلول Ringer البارد وغسل القطع جيدا.
لتجريد طبقة العضلات ، صب اثنين إلى ثلاثة ملليلتر من محلول رينجر الطازج الطازج المغطى بفقاعات الثلج البارد في صفيحة تشريح مغطاة بالمطاط السيليكوني تحت مجهر تشريح واستخدم المسامير لتأمين نهايات جزء واحد من الأنسجة المعوية في الطبق مع توجيه الجانب المخاطي لأسفل. باستخدام ملقط ناعم ، قم بتشريح طبقة العضلات بصراحة من الغشاء المخاطي الأساسي ، مع الحرص على عدم تمزيق أو إدخال أي ثقوب في الأنسجة. بمجرد إزالة طبقة العضلات ، قم بقطع قطعة كبيرة بما يكفي لفتح قطرها خمسة ملليمترات ووضع الأنسجة على قطعة من ورق ترشيح مثقوب بخمسة ملليمترات مبللة بالجانب المخاطي لمحلول رينجر لأسفل باستخدام خلفية سوداء لضمان تغطية الفتحة الموجودة في ورقة الترشيح بالكامل بواسطة الأنسجة دون تجاعيد.
لتركيب المستحضرات المعوية في غرفة Ussing ، قم أولا بإزالة أي محلول من الغرفة قبل تفكيكه. ضع ورقة الترشيح مع جانب الغشاء المخاطي المعوي لأسفل على الغرفة الجانبية المخاطية باستخدام العلامات السوداء لمحاذاة نافذة الغرفة مع الثقب الموجود في ورقة الترشيح. قم بتوصيل الغرفة الجانبية المصلية بعناية بالغرفة الجانبية المخاطية دون تحريك الورقة المعوية.
أعد ملء كلتا الغرفتين بسرعة باستخدام المخزن المؤقت HEPES وضع الفقاعات في الطرف الآخر من كل غرفة بعيدا عن الغشاء. أعد توصيل جسور الملح وتحقق مما إذا كان الجهد مستقرا ، ثم قم بنبض التيار للتأكد من أن التوصيلات على ما يرام قبل السماح للنظام بالتوازن لمدة 15 دقيقة تقريبا. لإجراء تجربة محتملة للتخفيف، اغسل أولا جانبي الغرفة بخمسة ملليلترات من المخزن المؤقت HEPES الطازج الذي تم تسخينه مسبقا لكل جانب.
قم بتشغيل نظام التسجيل واضبط النطاق على 250 مللي فولت. اضبط مواضع العلامة ، واضبط نظام التسجيل على القياس واضبط أنظمة غرفة Ussing على وضع المشبك. بمجرد استقرار إمكانات القياس ، استخدم البيانات للقياسات.
استبدل بسرعة المخزن المؤقت HEPES من الجانب المخاطي للغرفة بخمسة ملليلترات من المخزن المؤقت HEPES المخفف الدافئ المكمل بكلوريد الصوديوم 75 ملليمولار. بمجرد أن يصل جهد الغشاء إلى ذروته ، استبدل المخزن المؤقت للتخفيف من الجانب المخاطي بمخزن مؤقت HEPES جديد. للتأكد من أن الأنسجة قابلة للحياة ، أضف 10 ميكرومولار فورسكولين إلى الجانب المصلي.
بمجرد أن يصل فرق جهد الغشاء إلى ذروته ويبدأ في الانخفاض ، تنتهي التجربة. لقياس التوصيل الكهربائي عبر الظهارة وتيار الدائرة القصيرة الأساسي ، بعد غسل جانبي الغرفة كما هو موضح ، أضف خمسة ملليلترات من محلول Ringer الفقاعي الطازج إلى كل جانب واضبط نطاق نظام التسجيل على 2.5 فولت. اضبط مواضع العلامة ، واضبط نظام التسجيل على القياس ، واضبط نظام غرفة Ussing على وضع المشبك.
بمجرد استقرار تيار الدائرة القصيرة والتوصيل ، استخدم البيانات لإجراء قياسات خط الأساس. للتأكد من أن الأنسجة قابلة للحياة ، أضف Forskolin إلى الجانب المصلي كما هو موضح. بمجرد أن يصل فرق جهد الغشاء إلى ذروته ويبدأ في الانخفاض ، تنتهي التجربة.
في هذا التحليل التمثيلي ، كان التوصيل عبر الغشاء المخاطي الأساسي للجزء المعوي الصغير الأوسط أقل في الفئران القاضية كلودين -15 تحت ظروف الدائرة القصيرة مقارنة بتلك التي لوحظت في الفئران من النوع البري ، في حين أن تيار الدائرة القصيرة الأساسي كان أعلى. عند تخفيف كلوريد الصوديوم اللمعاني ، لوحظ اختلاف إيجابي في الجهد فيما يتعلق بالجانب المصلي في الفئران من النوع البري ، ولكن تم تقليل الفرق في الفئران القاضية كلودين-15. وبالمثل ، انخفضت النفاذية النسبية لكلوريد الصوديوم أيضا في الحيوانات بالضربة القاضية.
كشف حساب النفاذية المطلقة أن النفاذية المطلقة للصوديوم انخفضت في الفئران القاضية كلودين 15 ، في حين أن النفاذية المطلقة للكلوريد لم تفعل ذلك ، مما يشير إلى أن الانخفاض في النفاذية النسبية يرجع إلى انخفاض في نفاذية الصوديوم. كما هو متوقع ، لم تسبب إضافة Forskolin إلى الجانب المصلي من الغرفة فرقا كبيرا في تغيير تيار الدائرة القصيرة بين الفئران الضربة القاضية والفئران البرية. نظرا لأن الأجزاء المعوية أظهرت استجابة كبيرة بما يكفي ل Forskolin ، فقد اعتبرت مستحضرات الغشاء قابلة للحياة.
من المهم إجراء إزالة مناسبة لطبقة العضلات والتأكد من أن الأنسجة قابلة للحياة. يرجى شطف قسم تشريح الفئران ما إذا كان التحضير قابلا للتطبيق.
