이 프로토콜은 단단한 접합부의 운송 품질을 연구하는 데 사용됩니다. 희석 전위를 사용하여 투과 선택성을 측정하고 조직의 단단한 접합에 대한 이해를 얻을 수 있습니다. 이 기술은 구체적이며 상피의 기능적 연구를 위해 토착 조직을 사용합니다.
또한,이 기술은 조직의 실시간 생리적 특성을 측정하여 매우 유용합니다. 가장 큰 도전은 조직 준비입니다. 기술을 연습하고이 비디오를 보는 것이 도움이 될 것입니다.
조직 생존력을 확인하는 것도 중요한 단계입니다. 시작하려면 클라우딘-15 녹아웃 마우스에서 수집 한 장 조직의 원하는 세그먼트를 얼음처럼 거품이 많은 링거 (Ringer)의 용액에 넣고 지방과 결합 조직을 잘라냅니다. 지방과 결합 조직을 트리밍 한 후 장간막 부착물을 따라 잘라 각 세그먼트를 세로로 연 다음 세그먼트를 얼음처럼 차가운 링거 용액으로 되돌려 놓고 조각을 철저히 씻으십시오.
근육층을 벗기려면 두 세 밀리리터의 신선한 얼음 차가운 거품이 나는 링거 용액을 해부 현미경 아래의 실리콘 고무로 덮인 해부 판에 붓고 핀을 사용하여 점막 쪽이 아래를 향하게하는 접시에서 한 장 조직 세그먼트의 끝을 고정하십시오. 미세한 포셉을 사용하여 근육층을 하부 점막에서 무뚝뚝하게 해부하여 조직에 구멍을 뚫거나 구멍을 뚫지 않도록주의하십시오. 근육층이 제거되면 직경 다섯 밀리미터 개구부를 위해 충분히 큰 조각을 자르고 검은 색 배경을 사용하여 링거 용액 점막 측면으로 젖은 다섯 밀리미터 펀치 여과지 조각에 조직을 올려 놓고 여과지의 개구부가 주름없이 조직에 의해 완전히 덮여 있는지 확인하십시오.
장내 제제를 Ussing 챔버에 장착하려면 먼저 용액을 분해하기 전에 챔버에서 용액을 제거하십시오. 장내 준비 점막 측면이있는 여과지를 검은 색 표시를 사용하여 점막 측면 챔버 위에 아래로 놓아 챔버 창을 여과지의 구멍과 정렬하십시오. 장 시트를 움직이지 않고 혈청 측 챔버를 점막 측 챔버에 조심스럽게 연결하십시오.
HEPES 버퍼로 두 챔버를 빠르게 리필하고 멤브레인에서 멀리 떨어진 각 챔버의 반대쪽 끝에 버블링을 배치하십시오. 솔트 브리지를 다시 연결하고 전압이 안정적인지 확인한 다음 전류를 펄스하여 시스템이 약 15분 동안 평형을 이루도록 하기 전에 연결이 정상인지 확인합니다. 희석 가능성 실험을 수행하기 위해, 먼저 챔버의 양쪽을 측면 당 다섯 밀리리터의 신선한 미리 예열된 HEPES 버퍼로 세척한다.
녹화 시스템을 켜고 범위를 250밀리볼트로 설정합니다. 마커 위치를 설정하고 녹음 시스템을 측정하도록 설정하고 Ussing 챔버 시스템을 클램프 모드로 설정합니다. 측정 전위가 안정화되면 측정에 데이터를 사용하십시오.
챔버의 점막 쪽에서 HEPES 버퍼를 75 밀리몰 염화나트륨으로 보충 된 5 밀리리터의 가온 희석 HEPES 버퍼로 신속하게 교체하십시오. 막 전위가 최고조에 달하면 점막 측의 희석 버퍼를 신선한 HEPES 버퍼로 교체하십시오. 조직이 생존 할 수 있도록하려면 혈청 측에 10 마이크로 몰의 포스콜린을 첨가하십시오.
멤브레인 전위차가 최고점에 도달하고 감소하기 시작하면 실험은 끝났습니다. 경상피 전기 전도도와 기준선 단락 전류를 측정하기 위해 시연 된대로 챔버의 양면을 세척 한 후 5 밀리리터의 신선한 버블 링거 용액을 양쪽에 추가하고 기록 시스템의 범위를 2.5 볼트로 설정하십시오. 마커 위치를 설정하고, 녹음 시스템을 측정하도록 설정하고, Ussing 챔버 시스템을 클램프 모드로 설정합니다.
단락 전류와 컨덕턴스가 안정화되면 기준 측정에 데이터를 사용하십시오. 조직이 생존 할 수 있도록하려면 입증 된대로 혈청 측에 Forskolin을 추가하십시오. 멤브레인 전위차가 최고점에 도달하고 감소하기 시작하면 실험은 끝났습니다.
이 대표적인 분석에서, 중간 소장 세그먼트의 기준선 경점막 전도도는 야생형 마우스에서 관찰된 것에 비해 단락 조건 하에서 클라우딘-15 녹아웃 마우스에서 더 낮았고, 반면에 기준선 단락 전류는 더 높았다. 루미날 염화나트륨 희석시, 야생형 마우스에서 혈청 측에 대한 양의 전위차가 관찰되었지만, 클라우딘-15 녹아웃 마우스에서는 그 차이가 감소하였다. 유사하게, 염화나트륨의 상대적 투과성은 또한 녹아웃 동물에서 감소하였다.
절대 투과성의 계산은 클라우딘-15 녹아웃 마우스에서 나트륨의 절대 투과성이 감소한 반면, 염화물의 절대 투과성은 감소하지 않았으므로, 상대적 투과성의 감소는 나트륨의 투과성의 감소에 기인한다는 것을 시사한다. 예상한 바와 같이, 챔버의 혈청 측에 포스콜린의 첨가는 녹아웃과 야생형 마우스 사이의 단락 전류의 변화에 큰 차이를 야기하지 않았다. 장 세그먼트가 Forskolin에 대한 충분히 큰 반응을 보였기 때문에, 막 제제는 실행 가능한 것으로 간주되었다.
적절한 근육층 제거를 수행하고 조직이 실행 가능한지 확인하는 것이 중요합니다. 준비가 실행 가능한지 마우스의 해부 섹션을 헹구십시오.
